Characterization of the NMD mechanism in Arabidopsis thaliana – identification of new factors, analysis of new interaction and functional role of NMD mechanism

Abstract

Prawidłowy metabolizm RNA wymaga obecności zróżnicowanych mechanizmów kontroli w celu monitorowania i sprawdzania ilości oraz jakości powstających cząsteczek RNA. Mechanizmy te zachodzą podczas transkrypcji i wielu procesów post-transkrypcyjnych, zapewniając równowagę puli prawidłowych RNA poprzez degradację nieprawidłowo zsyntetyzowanych lub niefunkcjonalnych oraz zbędnych transkryptów. Jedną z najistotniejszych ścieżek kontroli jakości RNA jest mechanizm NMD (ang. Nonsense Mediated Decay), który prowadzi do rozpoznania nieprawidłowych transkryptów zawierających przedwczesny kodon terminacji translacji PTC. Cząsteczki takie powstają najczęściej w wyniku alternatywnego splicingu, mutacji lub błędów podczas transkrypcji. Główną funkcją NMD jest ochrona przed akumulacją potencjalnie szkodliwych białek. Ponadto NMD bierze udział w regulacji ekspresji informacji genetycznej prawidłowych transkryptów oraz pełni rolę w odpowiedzi na stres. NMD jest nie tylko mechanizmem kontroli jakości RNA ale ma również znaczenie dla homeostazy komórkowej. W pracy doktorskiej przedstawiono wyniki badań roślinnego mechanizmu NMD u modelowej rośliny Arabidopsis thaliana dotyczące określenia interaktorów białka UPF1, które jest głównym efektorem NMD. Wśród białek oddziałujących z UPF1 zidentyfikowano zarówno znane czynniki NMD jak również nowe składniki potencjalnie zaangażowane w ten proces. Wykazano udział roślinnych helikaz DEAD-box w przebiegu NMD, w szczególności homologów ludzkiej helikazy DDX3 (RH11, RH37, RH52) i helikazy DDX6 (białka RH6, RH8 i RH12) jako, odpowiednio, pozytywnych i negatywnych regulatorów tego procesu. Potwierdzono także ko-lokalizację tych helikaz z głównymi czynnikami NMD, co dodatkowo wskazuje na ich rolę w mechanizmie NMD. Ponadto wyniki wstępnych badań potwierdziły związek mechanizmu NMD z translacją i wskazały na fizjologiczną rolę NMD w reakcji na stres cieplny. Co więcej, eksperymenty pilotażowe zasugerowały możliwość, że modyfikacje m6A w cząsteczkach mRNA mogą przyczynić się do regulacji wydajności NMD.Metabolism of all RNA molecules requires various precise quality control mechanisms to monitor their quality and quantity. They occur during transcriptional and post-transcriptional processes, providing balance between RNA synthesis and decay by degrading incorrectly synthesized or non-functional and unnecessary transcripts. One of the most important cytoplasmic RNA quality control pathway is Nonsense-Mediated mRNA Decay mechanism (NMD), which recognizes aberrant mRNAs carrying premature termination codons (PTC). Aberrant PTC-containing transcripts most often result from alternative splicing, mutations or transcription errors. The major function of NMD is to protect against accumulation of potentially harmful proteins, but it also regulates the expression of genetic information of normal transcripts and plays a role in response to stress. Therefore, NMD is not only an RNA quality mechanism, but also contributes to cellular homeostasis. The dissertation presents the results of analysis of the plant NMD mechanism in the model organism Arabidopsis thaliana, mainly related to establishing interactors of UPF1 protein, which is a major NMD factor. The identified UPF1-interacting proteins included not only known NMD factors, but also novel potential components of the NMD machinery. The most interesting proteins were a group of helicases from the DEAD-box family, homologues of human DDX3 (RH11, RH37, RH52) and DDX6 (RH6, RH8 and RH12). Functional studies of these helicases confirmed their involvement in NMD efficiency as positive and negative regulators, respectively. Also their subcellular localization and co-localization with major NMD factors corroborated their role in this mechanism. In addition, results of preliminary studies supported the association of the NMD mechanism with translation and indicated a physiological role of NMD in response to heat stress. Moreover, pilot experiments suggested a possibility that m6A modifications in mRNA molecules may contribute to the regulation of NMD efficiency