Structural analysis of the eukaryotic small ribosomal subunit biogenesis by cryo-electron microscopy and image analysis

Abstract

L'assemblage des deux sous-unités ribosomiques (appelées 40S et 60S chez les eucaryotes) est un processus complexe, qui nécessite l'intervention de plus de 200 co-facteurs de maturation (CFM). Pour former des sous-unités ribosomiques matures et fonctionnelles, les CFM sont nécessaires à la maturation des ARN ribosomiques (ARNr), mais également à leur repliement correct et à leur assemblage avec les protéines ribosomiques (Rps). Malgré une identification quasi-exhaustive de ces CFM chez la levure et l'humain, leur fonction moléculaire précise reste à élucider. Par ailleurs, des défauts dans la synthèse des ribosomes ont récemment été associés à une liste croissante de maladies génétiques humaines (appelées ribosomopathies) et de cancers, ce qui nécessite une compréhension précise de chaque étape des mécanismes de biogenèse des ribosomes. De nombreuses études moléculaires et fonctionnelles ont récemment permis de définir plusieurs étapes successives de maturation cytoplasmique des particules pré-40S eucaryotes. Il est maintenant crucial d'intégrer ces descriptions moléculaires très détaillées des événements de maturation des ribosomes dans une vision tridimensionnelle de l'assemblage des ribosomes, et de comprendre le remodelage structural que les particules pré-ribosomiques peuvent subir au cours de leur maturation. Dans ce but j'ai déterminé, par cryo-microscopie électronique en transmission et analyse d'images, la structure 3D de précurseurs de la petite sous-unité ribosomique, purifiés à différentes étapes de maturation, chez l'Homme et la levure. Dans un premier temps, j'ai utilisé le CFM Tsr1 comme appât de purification dans des levures de phénotype sauvage, et déterminé la structure haute résolution de ces particules pré-40S cytoplasmiques. Ceci m'a permis de mettre en évidence trois étapes de maturations successives, commençant par l'autophosphorylation et le relargage du CFM Ltv1 et aboutissant à la flexibilité de la plateforme de la particule pré-40S. Ensuite, en collaboration avec le Dr Brigitte Pertschy (Graz, Autriche) j'ai déterminé la structure de particules pré-40S cytoplasmiques de levure, portant une mutation sur la protéine Rps20.Ceci a permis de mieux caractériser le rôle de Rps20 dans le relargage des CFM Rio2 et Ltv1 lors de l'assemblage de la sous-unité 40S. Enfin, j'ai déterminé la structure 3D des particules pré-40S humaines purifiées à un stade cytoplasmique tardif, à une résolution de 3 Å. Ce travail a été mené en collaboration avec l'équipe du Pr. Ulrike Kutay (ETH Zurich). Cette analyse nous a permis de localiser pour la première fois le CFM RIO1 sur les particules pré-40S cytoplasmiques tardives. En outre, nos résultats nous ont permis de mettre en lumière l'existence de remodelages structuraux inédits dans les dernières étapes de la maturation de la petite sous-unité ribosomique humaine.Ribosome assembly is a complex process that requires the intervention of more than 200 assembly factors (AFs). These proteins are essential for the processing and modification of ribosomal RNAs, as well as the structural assembly of ribosomal subunits. This mechanism, highly studied in yeast, generally conserved in eukaryotes, but has become more complex with evolution in higher eukaryotes. In addition, defects in ribosome synthesis have recently been associated with a list of human genetic diseases (called ribosomopathies) and cancers, via ribosome biogenesis disease. Numerous molecular and functional studies then made it possible to define several successive stages of cytoplasmic maturation of pre-40S particles in human and yeast. It is now crucial to incorporate these highly detailed molecular descriptions of ribosome maturation events into a three-dimensional view of ribosome assembly and to understand the structural remodeling of pre-ribosomal maturation particles. Using tandem purification methods, coupled with cryo-electron microscopy and isolated particle analysis, I have determined several high-resolution 3D structures of cytoplasmic pre-40S particles, in yeast and human, at different maturation steps. First, i determined the 3D structure of the pre-40S particles, purified using AF Tsr1-FPZ as a bait at 3.1 Å resolution. Structural heterogeneity tests indicated that the beak and platform domains are dynamic zones, and sheds new light on the structural remodeling events occurring during 40S subunit assembly. Moreover, in collaboration with the team of Dr. Brigitte Pertschy, we have determined the 3D structure of yeast cytoplasmic pre-40S particles carrying point mutations on Rps20. Our atomic models have allowed to highlight a close relationship between the correct assembly of Rps20 and the release of AFs Ltv1 and Rio2 from the maturing small ribosomal subunit. Finally, I also determined the 3D structures of human pre-40S particles trapped at a very late cytoplasmic maturation step, with a resolution of ~3 Å. This work was performed in collaboration with Prof. Ulrike Kutay's team (ETH Zurich). These data allowed us to uncover new steps in the cytoplasmic maturation of human pre-40S particles. This structural study allows us to propose new molecular mechanisms underlying the final steps of eukaryotic ribosomal assembly