Fripiat, Joseph G.

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Le 8 octobre 2014, la Fondation Nobel attribuait le prix Nobel de chimie à Eric Betzig (USA), Stefan W. Hell (Allemagne) et William E. Moerner (USA) pour leurs recherches dans le domaine de la microscopie à fluorescence à très haute résolution

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RESEARCH OUTPUTS / RÉSULTATS DE RECHERCHEAuthor(s) - Auteur(s) :Publication date - Date de publication :Permanent link - Permalien :Rights / License - Licence de droit d’auteur :Bibliothèque Universitaire Moretus PlantinInstitutional Repository - Research PortalDépôt Institutionnel - Portail de la Rechercheresearchportal.unamur.beLes prix Nobel de Chimie 2014: du microscope optique au nanoscopeFripiat, Joseph G.Published in:Revue des Questions scientifiques,Publication date:2015Document Versionle PDF de l'éditeurLink to publicationCitation for pulished version (HARVARD):Fripiat, JG 2015, 'Les prix Nobel de Chimie 2014: du microscope optique au nanoscope', Revue des Questionsscientifiques, VOL. 186, Numéro 4, p. 519-528.General rightsCopyright and moral rights for the publications made accessible in the public portal are retained by the authors and/or other copyright ownersand it is a condition of accessing publications that users recognise and abide by the legal requirements associated with these rights.            • Users may download and print one copy of any publication from the public portal for the purpose of private study or research.            • You may not further distribute the material or use it for any profit-making activity or commercial gain            • You may freely distribute the URL identifying the publication in the public portal ?Take down policyIf you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediatelyand investigate your claim.Download date: 23. Jun. 2020Les prix Nobel de Chimie 2014 :  du microscope optique au nanoscopeJoseph G. FripiatLaboratoire de Chimie Théorique, Unité de Chimie-Physique Théorique et Structurale Université de Namurjoseph.fripiat@unamur.beLe 8 octobre 2014, la Fondation Nobel annonçait l’attribution du prix Nobel de chimie à Eric Betzig (USA), Stefan W. Hell (Allemagne) et William E. Moerner (USA) pour leurs recherches dans le domaine de la microscopie à fluorescence à très haute résolution.On a longtemps cru que la résolution d’un microscope optique serait limi-tée à 0.2 nm, limite fixée par la loi d’Ernst Abbe :	   δ r ≈ λ2nsinαoù dr est la distance minimum qui doit séparer deux éléments pour être obser-vable; m est la longueur d’onde du rayonnement incident, n l’indice de réfraction du milieu, et a le demi-angle d’ouverture du faisceau incident entrant dans l’objectif du microscope. Pour la lumière visible dont les longueurs d’onde sont situées entre 400 et 800 nm, cette équation signifie que, pour que deux objets soient observables, la distance les séparant doit être supérieure à 0.2-0.4 nm dépendant de la longueur d’onde de la lumière incidente. Les objets tels qu’un cheveu (±0.5 mm), une cellule (de l’ordre de 1 à 100 nm), une bactérie (de l’ordre de 10 nm), une mitochondrie cellulaire (de l’ordre de 1 nm) peuvent être obser-vés au microscope optique.Revue des Questions Scientifiques, 2015, 186 (4) : 519-528520 revue des questions scientifiquesSi on souhaite observer les composantes de la cellule dont les dimensions sont de l’ordre d’une dizaine de nanomètres comme par exemple les virus (±100 nm), les protéines (±10 nm), il faut recourir à d’autres techniques, telles que la microscopie électronique.Celle-ci permet d’observer plus finement les cellules, mais elle utilise des faisceaux de particules dont la longueur d’onde suivant la relation de de Broglie est de l’ordre de 0.0025 nm (pour une différence de potentiel de 200 kV), ce qui n’est pas sans danger pour les composantes des cellules.Le mérite des lauréats est d’avoir trouvé le moyen de dépasser la limite théorique de résolution de la microscopie optique en utilisant des molécules fluorescentes: Eric Betzig et William Moermer avec la microscopie monomo-léculaire et Stefan Hell avec la microscopie à fluorescence STED.Les Lauréats Stefan W. Hell 1Stefan Hell est né en 1962 à Arad, Roumanie, ville située à moins de 20 km de la frontière hongroise, à l’extrémité occidentale de la Tran-sylvanie. Il est issu d’une famille appartenant à la minorité allemande établie dans la région. Il émigre avec sa famille en République fédérale allemande en 1978.Hell entame des études de physique en 1981 à l’Université de Heidelberg où il présente sa thèse de doctorat en 1990. Le titre de celle-ci était «Imaging of transparent microstructures in a confocal microscope», son promoteur étant le physicien de l’état solide Siegfried Hun-klinger. Déjà à cette époque, Hell cherchait le moyen de dépasser la limite de résolution des microscopes optiques établie par Ernst Abbe.De 1991 à 1993, Hell a travaillé au Laboratoire européen de biologie mo-léculaire à Heidelberg. De 1993 à 1996, il a séjourné à l’Université de Turku (Finlande) au Département de physique médicale où il développa les principes 1. From Wikipedia, the free encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Stefan_Hell. nobel de chimie 2014 : du microscope optique au nanoscope 521du microscope «Stimulated emission depletion (STED)». Il a obtenu son «ha-bilitation» en physique à l’Université de Heidelberg en 1996. En 1997, Hell a été engagé par l’Institut Max Planck de chimie biophysique à Göttingen où il fut nommé directeur en 2002. Il y fonda le Département de nanobiophotonics. Depuis 2003, il est aussi le chef du Département de nanoscopie optique du Centre de recherches sur le cancer (DFKZ) et professeur à l’Université de Heidelberg. Eric Betzig2Robert Eric Betzig est né à Ann Arbor (Michigan, USA) en 1960. Il fit ses études de physique à l’Institut californien de tech-nologie (CalTech) où il obtient son di-plôme de bachelier en science (BS) en 1983. Il obtient ensuite son master en 1985 et son doctorat en physique appliquée en 1988 à l’Université de Cornell. L’objet de sa thèse concernait le développement de «l’optique de champ proche».Après avoir défendu sa thèse de doctorat, Betzig a rejoint le Département de physique des semi-conducteurs de «AT&T Bell Laboratories» où il y déve-loppa des applications concernant la spectroscopie des semi-conducteurs et la microscopie fluorescente de haute résolution.En 1996, Betzig quitta le monde académique et entra dans la société fami-liale «Ann Arbor Machine Company» comme vice-président de la recherche et développement. Il chercha à mettre au point une technologie de «commande de mouvement à grande vitesse» mais ce fut un échec commercial. Il s’est re-trouvé sans emploi.  Avec un ancien collègue de Bell Labs, Harald Hess, au chômage également, ils ont construit, chez eux, le premier microscope PALM (photo activated localization miscoscopy).En 2006, il est engagé par le «Howard Hughes Medical Institute» (Janelia Farm Research Campus, Loudon County, Virginia) pour développer les tech-niques de microscopie fluorescente à haute résolution. 2. From Wikipedia, the free encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Eric_Betzig.522 revue des questions scientifiquesWilliam E. Moerner3William Moerner est né en 1953 à Pleasan-ton en Californie. Il fit ses études de bache-lier à l’Université Washington à St Louis où il obtient trois diplômes: un B.S. (ba-chelor of science) en physique, un B.S. en génie électrique et un A.B. (bachelor of arts) en mathématiques. Ensuite, il rejoint le groupe de Albert J. Sievers à l’Université de Cornell où il obtient son diplôme de master en 1978. Il présente sa thèse de doctorat en 1982. Le titre était « vibrational relaxation dynamics of an IR-laser-excited molecular impurity mode in alkali halide lattices».De 1981 à 1995, Moerner a travaillé au Centre de recherche IBM-Almaden à San Jose en Californie. Il fut aussi professeur visiteur à ETH-Zurich (1993-1994). Ensuite, il occupa de 1995 à 1998 la chair de chimie-physique à l’uni-versité de Californie à San Diego. En 1997, il est nommé professeur visiteur «Robert Woodward» à l’Université d’Harvard. En 1998, il est nommé à l’Uni-versité de Stanford (Californie) comme professeur de chimie et de physique appliquée. Il dirigea le Département de chimie de 2011 à 2014. Ses domaines de recherche sont : la spectroscopie et la microscopie de haute résolution moléculaire, la chimie-physique, la biophysique, la nano-optique, les polymères photo-réfractifs, etc.Leurs travauxCes trois chercheurs ont chacun contribué à accroître la résolution des microscopes optiques à fluorescence.La microscopie à fluorescence est une technique qui utilise le phénomène de fluorescence au lieu de la réflexion ou de l’absorption du rayonnement lumi-neux par l’échantillon. Dans ces microscopes, l’échantillon est lui-même la source lumineuse.3. From Wikipedia, the free encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/William_E._Moer-ner nobel de chimie 2014 : du microscope optique au nanoscope 523La luminescence est provoquée par le passage de la molécule d’un état initial singulet vers un état singulet excité sous l’action d’un rayonnement suivi directement d’une émission lumineuse due à la dé-excitation de la molé-cule (voir Fig. 1) soit à partir de cet état (fluorescence) soit d’un état triplet excité (phosphorescence). Dans ce dernier cas, il y a passage de l’état singulet excité à l’état triplet ce qui est en principe interdit par les règles de sélection de la mécanique quantique. Ce phénomène s’explique par le couplage spin-orbite et est plus lent à s’effectuer. On observe souvent une émission de longueur d’onde plus élevée car la molécule retourne à l’état fondamental à partir du niveau vibrationnel le plus bas de l’état excité concerné. Ce phénomène de déplacement (déplacement de Stokes) du spectre d’émis-sion vers les longueurs d’onde plus élevées par rapport à celui du rayonnement initial permet la détection des molécules fluorescentes (fluorophores) et est utilisé en microscopie. Plus le déplacement de Stokes est important, plus il est facile d’observer le phénomène de fluorescence.Fig. 1 : Diagramme de Jablonski44. Fig.1 extraite de « Principe physique de la fluorescence», Tounsia Aït-limane, UMRS 938, CDR Saint-Antoine, CHU Saint-Antoine. http://www.snv.jussieu.fr/~wboudier/ens/cours/cours-mec-fluorescence.pdf524 revue des questions scientifiquesUn certain nombre de molécules sont naturellement fluorescentes; d’autres peuvent être combinées avec une substance fluorescente pour émettre ce rayon-nement. Ainsi en ajoutant des molécules fluorescentes à une préparation, les biologistes sont capables de mettre en évidence certaines structures de la cellule. Par exemple, les généticiens utilisent ce procédé en ajoutant aux gènes une molécule telle que la molécule GFP (green fluorescent proteine) sur les protéines qu’ils veulent étudier. Ce procédé a valu, en 2008, le prix Nobel de chimie à Roger Tsien, Martin Chalfie et Osamu Shinomura. La résolution de ces micros-copies reste cependant soumis à la limite de Abbe.Le mérite des trois lauréats de cette année est d’être parvenu à dépasser cette limite.En 1994, Hell montre qu’il est possible théoriquement de descendre en dessous de la limite de Abbe avec la microscopie optique STED (stimulated emission depletion)5. Dans cette technique mise au point en 2000 6 et décrite dans la Fig. 2, deux lasers sont utilisés. L’un excite les molécules de l’état fon-damental à l’état excité provoquant la fluorescence (émission spontanée) tandis que l’autre de fréquence plus faible est utilisé pour «éteindre» la fluorescence (émission stimulée) dans tout l’échantillon excepté dans une région choisie de l’ordre du nanomètre. Cette extinction est obtenue en réglant la fréquence du second rayonne-ment laser de telle manière que celle-ci correspond à la différence d’énergie entre l’état excité et l’état fondamental des fluorophores.Les atomes se trouvant dans l’état excité retournent donc à l’état fondamental par émission d’un photon de même fréquence que la stimu-lation produisant ainsi deux photons de même longueur d’onde. C’est le même principe utilisé dans les lasers pour amplifier la lumière.5. S.W. Hell et J. Wichman, Opt. Lett. 19, 780 (1994); S.W. Hell et M. Kroug, Appl. Phys. B 60, 495 (1995).6. T.A. Klar, S. Jakobs, M. Dyba, et S.W. Hell, Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 8206 (2000). nobel de chimie 2014 : du microscope optique au nanoscope 525Fig. 2 : Microscope STED 7 Il suffit de balayer l’échantillon, nanomètre par nanomètre, pour construire une image dont la résolution dépasse la limite de Abbe. Une méthode similaire (Saturated Structural Illuminating Microscopy- SSIM) a été mise au point par Gustafsson8. Ces techniques peuvent être classées comme une microscopie optique à haute résolution pour des ensembles de fluorophores (super-resolved ensemble fluorophore microscopy).En général, quand on effectue des études spectroscopiques sur des com-posés chimiques, les mesures se portent sur un ensemble de molécules et le résultat obtenu est une moyenne. Moerner et Kador9 ont été les premiers scien-tifiques, en 1989, à mesurer expérimentalement l’absorption lumineuse d’une simple molécule.7. Fig. 2 extraite de S.W. Hell, M. Dyba et S. Jakobs, Current Opinion in Neurobiology, 14, 599 (2004).8. M.G. Gustafsson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 1301 (2005).9. W.E. Moerner and L. Kador, Phys Rev. Lett. 62, 2535 (1989).526 revue des questions scientifiquesEn 1997, Moerner a rejoint l’Université de Californie à San Diego où se trouvait Roger Tsien, prix Nobel 2008, travaillant sur la protéine GFP. Moer-ner et ses collaborateurs ont découvert qu’on pouvait «allumer» et «éteindre» la fluorescence d’une variante de la GFP 10 (voir Fig. 3). Quand on soumet cette substance à un rayonnement de longueur d’onde égale à 488 nm (point A de la Fig. 3), la protéine émet par intermittence un rayonnement fluorescent à 525 nm et dont l’intensité diminue au cours du temps (oscillation entre le point A et le point I) pour finalement disparaitre complétement (point N). Il n’est alors plus possible de réactiver la molécule sauf si on appliquait un rayonnement de longueur d’onde de 405 nm (passage de l’état N à N* et ensuite vers les états A et A*). Moerner et son équipe ont dispersé des molécules de cette protéine dans un gel, la distance les séparant étant plus grande que 0.2 nm, la limite de Abbe. Ils ont appliqué ce rayonnement de 405 nm très localement dans l’échantillon. En observant ce gel à travers un microscope optique, ils ont pu observer une lueur émise par ces molécules individuelles.Fig. 311 : GFP dans l’ état A est excité vers l’ état A* et retourne à l’ état A en émettant un photon. Quand on atteint le point I à partir de A, il n’y a plus de fluorescence à moins que la molécule passe de l’ état I à l’ état A. Quand la molécule passe de l’ état I à l’ état N, il n’y a pas non plus de fluorescence à moins que la molécule passe de l’ état N à l’ état N* par absorption d’un rayonnement à 405 nm et la GFP  retourne à l’ état A ou A*.10. R.M. Dickson, A.B. Cubitt, R.Y. Tsien, W.E. Moerner, Nature 388, 355 (1997).11. Fig. 3 extraite de la référence 9. nobel de chimie 2014 : du microscope optique au nanoscope 527En partant de cette observation, Moerner et ses collaborateurs ont sug-géré que l’on pouvait utiliser cette protéine comme des marqueurs fluorescents pour étudier des processus dépendant du temps, comme des interrupteurs moléculaires ou comme des mémoires optiques. Eric Betzig, comme Stefan Hell, cherchait, depuis le début de sa carrière, un moyen de surmonter la limite de Abbe. Au début des années 1990, il a participé au développement de la microscopie optique à champs proche (NSOM) 12 mise au point au Laboratoire Bell dans le New Jersey. Dans cette technique, on n’observe plus la lumière réfléchie par l’objet mais on étudie l’onde évanescente obtenue en plaçant la pointe de l’émetteur formé par une fibre optique à une distance plus faible que la longueur d’onde du rayonnement par rapport à la surface de l’échantillon. Ce microscope peut dépasser la limite de Abbe mais permet seulement d’étudier les structures qui se trouvent juste en dessous de la surface des cellules. Cette technique a permis de détecter des fluorophores isolés mais, vu les difficultés techniques rencontrées dans sa mise en œuvre, son utilisation est restée limitée à l’étude des surfaces.Inspiré par les travaux de Moerner, il chercha alors s’il pouvait marquer les structures avec des molécules fluorescentes qui rayonnent avec des couleurs différentes. L’idée était de construire un microscope qui enregistre une image par couleur. Si toutes les molécules qui émettent une même couleur étaient dispersées dans l’échantillon à une distance plus grande que 0.2 nm, on pour-rait localiser exactement leur position. Ensuite, il suffit de combiner ces images obtenues avec des couleurs différentes pour obtenir une carte complète même si les molécules se trouvent à une distance inférieure de la limite de Abbe13.En 1996, Betzig quitta les Laboratoires Bell pour rejoindre la Société fami-liale mais après plusieurs années dans le privé, il reprit ses recherches sur la microscopie de très haute résolution.En 2005, il revient à son idée émise en 1995 mais au lieu de jouer avec les couleurs, il chercha des protéines dont l’émission fluorescente pouvait être activée ou désactivée à volonté.12. E. Betzig,R.J. Chichester, Science 262, 1422 (1993); G.P. Collins, Phys. Today 47 (5), 19 (1994).13. E. Betzig, Opt lett. 20, 237 (1995).528 revue des questions scientifiquesCela a conduit en 2006 à une nouvelle génération de techniques de micros-copie de super-résolution qui a été mise au point simultanément par Eric Bet-zig et Sam Hess14 (PALM, PhotoActivated Localization Microscopy) et par Xiawey Zhuang15 (STORM, STochastic Optical Reconstruction Microscopy). Ces deux techniques sont similaires et consistent à rendre transitoirement et aléatoirement fluorescentes, en les soumettant à un faible rayonnement inter-mittent, une petite partie des fluophores de l’échantillon pour pouvoir les indi-vidualiser et les localiser (voir Fig. 4). Dû à leur petit nombre, ces fluorophores sont séparés pour la plupart d’entre eux par une distance plus grande que la limite de Abbe. Ce processus est répété un grand nombre de fois pour permettre la reconstruction d’images avec une résolution nanométrique.Fig. 4 : Le principe du microscope «mono-moléculaire» 16.Les méthodes développées par les trois lauréats sont à l’origine de nouvelles techniques de nanoscopie et sont maintenant utilisées couramment par les biochimistes. Ces travaux ont été couronnés par le prix Nobel de chimie mais auraient pu être honorés par le prix Nobel de physique. Les résultats obtenus sont le fruit d’une recherche qui au départ relevait plutôt du domaine de la physique mais dont le résultat final touche au domaine de la biochimie et de la biologie.14.  E. Betzig, G.H. Patterson, R. Sougrat, O.W. Lindwasser, S. Olenych, J.S. Bonifacino, M.W. Davidson, J. Lippincott-Schwartz, H.F. Hess, Science 313, 1642 (2006).15. M.J. Rust, M. Bates, X. Zhuang, Nat Methods 3, 793 (2006).16. Fig. 4 extraite de l’information publiée par la Fondation Nobel pour le public disponible sur http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2014/popular.html

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