Development of electrochemical DNA sensors based on the incorporation ferrocene labelled dATP

Abstract

Aquesta tesi doctoral està enfocada en el desenvolupament de sensors electroquímics d’ADN, que són dispositius analítics descentralitzats per detectar sequencies d’ADN. Aquest tipus de sensors tenen aplicacions en moltes arees incloent: diagnostics clínics, control de malalties, anàlisi d’aliments, ciències forenses, bioterrorisme i control ambiental. Tanmateix, el sensors electroquímics d’ADN tenen algún problemes que encara s’han de solucionar, incloent la necessitat d’amplificar la sequencia d’ADN diana, la necessitat de generar ADN de cadena simple per a una posterior hibridació amb un ADN de captura complementari i finalment el marcatge d’aquest ADN hibridat per procedir amb la detecció. Aquesta tesi està enfocada en la eliminació d’alguna t’aquestes etapes per tal de simplificar i millorar els sensors electroquímics d’ADN existents. Per eliminar l’etapa de marcatge d’ADN posterior a la hibridació hem utilitzat dATP modificat amb ferrocè durant l’etapa d’amplificació. Per tal d’eliminar l’etapa de generació de cadena simple hem utilitzat dues estratègies diferents: l’ús de “tailed primers” enlloc de primers normals, o alternativament, l’amplificació de l’ADN diana en fase sòlida. Hem comprovat que el dAEFcTP s’incorpora adecuadament en experiments d’extensió de primer i hem utilitzat el dAEFcTP conjuntament amb tailed primers per desenvolupar dos sensors electroquímics per detectar els patògens: K. armiger i B. anthracis. A més, hem estudiat l’efecte que te el ratio dAEFcTP:dATP en el rendiment de l’amplificació, el pic d’oxidació de ferrocè i el límit de detecció. També hem estudiat l’efecte de la solución electrolit en el pic d’oxidació de ferrocè. Finalment, hem explorat l’ús de dAEFcTP amb el mètode isotèrmic d’amplifició d’ADN: recombinase polymerase amplification.Esta tesis doctoral está enfocada en el desarrollo de sensores electroquímicos de ADN, que són dispositivos analíticos descentralizados para la detección de secuencias de ADN. Este tipo de sensores tienen aplicaciones en muchas areas, incluyendo: el diagnóstico clínico, el control de enfermedades, el análisis de alimentos, la ciencia forense, el bioterrorismo i el control ambiental. Aun así, los sensores electroquímicos de ADN presentan problemas que aun tienen que ser resueltos, incluyendo la necesidad de amplificar la secuencia de ADN diana, la necesidad de generar ADN de cadena simple para una posterior hibridación con un ADN de captura complementario y finalmente el marcaje de este ADN hibridado para proceder con su detección. Esta tesis está enfocada en la eliminación de alguna de estas etapas para simplificar y mejorar los sensores electroquímicos de ADN existentes. Con tal de eliminar la etapa de marcaje de AD posteriora la hibridación hemos usado dATP modificado con ferroceno (dAEFcTP) durante la etapa de amplificación. Para eliminar la etapa de generación de ADN de cadena simple hemos utilizado dos estrategias distintas: el uso de “tailed primers” en lugar de primer convencionales, o alternativamente, la amplificación del ADN diana en fase sólida. Hemos comprobado que el dAEFcTP se incorpora adecuadamente en experiments de extensión de primer i hemos utilizado el dAEFcTP conjuntamente con tailed primers para desarrollar sensores electroquímicos para detectar los patógenos: K. armiger i B. anthracis. Además, hemos estudiado el electro que tiene el ratio dAEFcTP:dATP en el rendimiento de la amplificación, el pico de oxidación de ferrocene y el límite de detección del método.Además, tambinñen hemos estudiado cual es el efecto de la solución electrolyto de sorporrte en el pico de oxidaciñon del ferroceno. Finalmente hemos explorado el uso de dAEFcTP en conjuncuión con el método isotérmico de amplificación de ADN: recombinsae polymerase amplificationThis thesis is focused on the development of electrochemical DNA sensors, which are decentralized analytical devices for use at the point-of-need for the detection of DNA sequences. These sensors can find widespread application in a number of diverse areas, including clinical diagnostics, disease monitoring, food analysis, forensics, bioterrorism and environmental control. However, electrochemical DNA sensors still have a number of problems that need to be addressed, including a need for the amplification of the target sequence, the need for post-amplification generation of single stranded DNA, target hybridization with a complementary capture probe and finally further reporting steps to detect the hybridized target DNA sequence. In this thesis we focused on the elimination of some of these steps to bring electrochemical DNA sensors closer to the point-of-need. To eliminate the reporting step we used ferrocene labelled dATP (dAEFcTP) to obtain already labelled target amplicons. To eliminate the single stranded generation step we followed two different strategies, the use of tailed primers instead of regular primers, or, alternatively performing DNA amplification directly on the electrode surface. The incorporation of dAEFcTP has been demonstrated in primer extension and amplification experiments. dAEFcTP and tailed primers have been used to develop a singleplex electrochemical sensor to detect K. armiger in seawater samples, and a duplex electrochemical sensor to detect B. anthracis in real samples. The effect of the dAEFcTP:dATP ratio on DNA amplification yield, ferrocene peak intensity and limit of detection has been studied, as well as the effect of the electrolyte solution on the ferrocene peak intensity. Finally, the use of dAEFcTP in combination with isothermal recombinase polymerase amplification was explored