Faccini, Lavinia Schuler

Fraga, Lucas Rosa

Gomes, Julia do Amaral

Kowalski, Thayne Woycinck

Rengel, Bruna Duarte

Vianna, Fernanda Sales Luiz

Portuguese

Lume 5.8

38ª SEMANA CIENTÍFICA DO HOSPITAL DE CLÍNICAS DE PORTO ALGREE                                                                               Clin Biomed Res 2018; 38 (Supl.) 207  P1074 Susceptibilidade genética e malformações cardíacas: análise de HAND2 na embriopatia da talidomida Bruna Duarte Rengel, Thayne Woycinck Kowalski, Julia do Amaral Gomes, Lavínia Schüler-Faccini, Lucas Rosa Fraga, Fernanda Sales Luiz Vianna - HCPA  Introdução: A talidomida, sintetizada na década de 50, leva a uma condição conhecida como Embriopatia da Talidomida (TE), que consiste no conjunto de malformações, especialmente nos membros, coração, olhos e orelhas. A focomelia é a anomalia mais observada nos membros e no coração as mais comuns são persistência do ducto arterial, defeito do septo ventricular, defeito do septo atrial e estenose pulmonar. HAND2 está envolvido na formação de diversos órgãos, com coração e membros, e é codificado pelo gene HAND2, o qual tem dois éxons. Um estudo recente identificou que HAND2 interage com TBX5 e que essa interação é inibida na presença de talidomida. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar o papel de HAND2 na susceptibilidade genética à TE. Métodos: O DNA foi extraído de amostras de saliva de 35 indivíduos com TE. Foi feito PCR para amplificação e sequenciamento Sanger dos éxons de HAND2. As sequências foram lidas com o programa CodonCode® Aligner v.3.0.1. O equilíbrio de Hardy-Weinberg foi calculado por teste qui-quadrado. As análises in silico foram feitas com os programas PredictSNP2 e MutationTaster para predições de efeito das variantes na proteína; Human Splicing Finder para sítios de splicing; miRBase para sítios de miRNA; MethPrimer para alteração em ilhas CpG; Enhancer Atlas 2.0 para sítios de reforçadores; e pacote do R motifbreakR para alterações em sítios de fatores de transcrição. O software SPSS v.18 foi usado para as análises estatísticas. Resultados: Dos indivíduos avaliados, 12% (3/25) tem anomalias cardíacas congênitas e 52% (10/19) desenvolveram efeitos cardíacos ao longo da vida. Na análise de HAND2, observou-se uma variante polimórfica sinônima p.P51 (rs59621536) no éxon 1 de 3 indivíduos. Não foi observada nenhuma variante no éxon 2. As frequências genotípicas e alélicas de p.P51 foram diferentes entre o grupo TE e amostra de referência (banco de dados GnomAD) (p=0,005; p=0,003, respectivamente). Nas análises in silico, a variante foi classificada como neutra, sem alterações em sítios miRNA e sítios de splicing. Observou-se a alteração de duas ilhas CpG adjacentes à variante e modificação de sítios de ligação dos fatores de transcrição MECP2 e PLAG1. Conclusões: A variante p.P51 parece afetar a regulação de HAND2 por meio de alterações à nível epigenético já que não altera a estrutura proteica mas leva modificação de duas ilhas CpG e do sítio de ligação de MECP2, que realiza a regulação de sequências metiladas. Unitermos: Talidomida; HAND2; Cardiopatia congênita.  P1115 I                          RNA                                      à 3’UTR         BTD Gerda Cristal Villalba Silva, Fernanda Ludwig-Sperb, Ida Vanessa Doederlein Schwartz - UFRGS  A biotinidase (EC 3.5.1.12) é a enzima responsável por liberar a biotina da biocitina, e atua como cofator para diversas carboxilases. A deficiência de biotinidase (DB), doença de herança autossômica recessiva, pode resultar em problemas neurológicos e dermatológicos quando não tratada precocemente. O gene que codifica a biotinidase, BTD, é composto por 4 éxons e sua região 3’UTR possui 329 pb. Regiões 3’UTR são sítio de ação de reguladores pós-transcricionais que influenciam na expressão gênica, entre eles os microRNAs (miRNAs). A investigação de miRNAs com alvos em BTD poderia contribuir na compreensão da relação entre o genótipo e o fenótipo bioquímico de pacientes, que nem sempre é clara. Objetivos: identificar miRNAs e outros elementos regulatórios que possam estar influenciando nos níveis da enzima biotinidase dos pacientes. Metodologia: Para predição dos miRNAs foram utilizados os softwares miRBase e miRTarBase, baseados em similaridade de sequência; StarBase e TarBase, que utilizam alinhamento múltiplo entre espécies; TargetScanHuman, que combina status de ligações termodinâmicas e conservação evolutiva; e o banco miRDB. Para a análise dos demais elementos regulatórios, utilizou-se o RegRNA2.0. Resultados e discussão: Foram encontrados 42 miRNAs pelo software miRBase; 11 pelo miRTarBase; 2 pelo StarBase, 22 pelo TarBase e 1 pelo TargetScanHuman. Estes miRNAs estão relacionados com sinalização celular; vias de glicosilação; metabolismo de arginina, biotina, tirosina e tiamina. Na rota metabólica da Biotina, foram identificados miRNAs em genes alvos que interagem com o BTD: SPCS1 e SPCS3, subunidades do complexo sinal da peptidase e HLCS, um importante regulador de carboxilases dependentes de biotina. Os principais miRNAs encontrados foram hsa-miR-7-5p,supressor de proliferação celular e indutor de apoptose,hsa-miR-34a-5p, relacionado com proliferação celular  e hsa-miR-145, identificado em recém-nascidos e expresso no fígado. Além disso, foram encontrados 6 elementos ricos em AU associados à 3’UTR, cuja função foi elucidada em diversos estudos, sendo elas decaimento e regulação da instabilidade  do mRNA, e resposta ao stress celular. A região 3’UTR do gene BTD não havia sido caracterizada anteriormente, e até o presente estudo  não há interações fortemente validadas entre os miRNAs e o gene BTD, o que deixa sua validação experimental como uma perspectiva futura. Número do Projeto: 160480. Apoio Financeiro: FIPE-HCPA. Unitermos: Biotinidase;  MiRNAs;  Elementos ricos em AU.  P1147 Análise de regiões alvo no genoma humano para inserção de sequências usando sistema CRISPR/CAS9 Paola Barcelos Carneiro, Marina Hentschke Lopes, Martiela Vaz de Freitas, Ursula da Silveira Matte - HCPA  Introdução: CRISPR (do inglês:Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) é um mecanismo imune de procariotos contra infecções virais aplicado à edição gênica em  outros organismos. O funcionamento se baseia em  uma endonuclease capaz de clivar em uma região específica mediada por uma sequência de RNA com 20 nucleotídeos complementar ao sítio-alvo. Esse sistema pode ser utilizado para inserção de sequências de DNA em regiões específicas. Objetivo: Neste contexto, o objetivo deste trabalho é avaliar duas regiões gênicas associadas aos loci  THUMPD3-AS1 e AAVS1 como potenciais sítios-alvo para inserção gênica. Métodos: Para isso utilizaram-se métodos de identificação de potenciais off-targets  e de eficiência a partir de análises computacionais. Para a predição de off-targets as sequências foram submetidas à ferramenta CHOPCHOP utilizando como base o genoma humano. Além disso, três aspectos foram avaliados para escolha das sequências: o número de mismatches, o conteúdo GC e a eficiência da endonuclease. Resultados: Foram obtidas cinco sequências-alvo sem mismatch para THUMPD3-AS1 e duas para AAVS1. O conteúdo GC ficou entre 50 e 70%, visto que esta é a porcentagem ideal para eficiência do sistema no que se refere à estabilidade da molécula híbrida de DNA e RNA e à concentração de domínios CG. Além desses critérios, também foi levada em consideração a eficiência de corte associado à região PAM adjacente a sequência do sítio-alvo. Para confirmar a predição realizada pela ferramenta CHOPCHOP, as sequências foram submetidas a um alinhamento local com a utilização da ferramenta BLASTn. A avaliação foi estipulada levando em consideração as regiões seed (localizadas a 10-12 nucleotídeos a montante do códon PAM) e PAM, que são determinantes na complementaridade do mRNA e atividade da  Cas9, respectivamente.  A averiguação confirmou 

Susceptibilidade genética e malformações cardíacas: análise de HAND2 na embriopatia da talidomida

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Susceptibilidade genética e malformações cardíacas: análise de HAND2 na embriopatia da talidomida

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