A aplicação da refrigeração como ferramenta para conservação da qualidade microbiológica do leite caprino durante a estocagem e transporte determinou a seleção de uma microbiota tipicamente psicrotrófica nesse produto. Micro-organismos psicrotróficos são potenciais produtores de enzimas proteolíticas, caracterizadas usualmente por serem termo-resistentes, e responsáveis pela deterioração da caseína do leite mesmo após os tratamentos térmicos mais utilizados em laticínios, como a pasteurização e a ultra-alta-temperatura. Pseudomonas spp. são considerados os principais micro-organismos psicrotróficos e proteolíticos presentes em leite. O presente estudo teve como objetivos avaliar a qualidade microbiológica de leite de cabra, obter isolados de Pseudomonas spp. autóctones desse produto e caracterizar sua atividade e potencial proteolítico. Doze propriedades rurais com atividade de caprinocultura leiteira foram selecionadas nas regiões de Viçosa e Muriaé, Minas Gerais, das quais 61 amostras de leite de cabra foram coletadas e submetidas a análises microbiológicas para contagens de aeróbios mesófilos, enterobactérias, coliformes, Escherichia coli, psicrotróficos totais e proteolíticos, e estimativas de Pseudomonas totais e proteolíticos. As médias das contagens obtidas para todas as amostras foram: 5,04 log UFC/mL para aeróbios mesófilos, 3,34 log UFC/mL para enterobactérias, 2,85 log FC/mL para coliformes, 0,22 log UFC/mL para E. coli, 3,62 log UFC/mL para psicrotróficos totais, 2,73 log UFC/mL para psicrotróficos proteolíticos, 3,87 log UFC/mL para Pseudomonas e 3,43 log UFC/mL para Pseudomonas proteolíticos. Embora a média de aeróbios mesófilos tenha sido inferior ao limite recomendado pela legislação brasileira vigente (5,70 log UFC/mL), as amostras de leite de cabra apresentaram altas contagens de micro-organismos indicadores de higiene, o que demonstra deficiências higiênicas durante as diferentes etapas de produção e estocagem desse produto. Em 22 amostras de leite cru as contagens de psicrotróficos proteolíticos representaram mais de 50% das contagens de psicrotróficos, indicando o potencial proteolítico desse grupo em leite de cabra. A mesma relação foi observada em relação à presença de atividade proteolítica de Pseudomonas spp., que em 27 amostras essa proporção foi maior que 50% das contagens totais estimadas de Pseudomonas. Considerando as placas utilizadas para enumeração de Pseudomonas, 496 colônias que apresentaram atividade proteolítica foram selecionadas, purificadas e as culturas obtidas submetidas aos seguintes testes para identificação preliminar: morfologia pela coloração de Gram, oxidase e fermentação de glicose. Baseado nesses resultados, 107 isolados foram inicialmente identificados como Pseudomonas spp., e submetidos a rep-PCR para caracterização de seus perfis genéticos. Considerando taxas de similaridade entre 80 e 85%, 33 perfis genéticos diferentes foram caracterizados; 36 isolados não apresentaram perfil genético com o protocolo de rep-PCR utilizado. Os isolados ainda foram submetidos a PCR para identificação de espécies com primers específicos para P. aeruginosa (38 isolados identificados) e P. fluorescens (4 isolados); 61 isolados apresentaram produtos de amplificação para ambas as reações, e 4 para nenhuma, e foram considerados como Pseudomonas spp. considerando os testes laboratoriais realizados na triagem. Todos os
isolados foram submetidos a PCR para detecção do gene apr, responsável pelam codificação da enzima metaloprotease alcalina, sendo identificados 41 (38,3%) positivos. Mesmo isolados que não apresentaram gene apr foram capazes de produzir enzimas proteolíticas a 7, 25 ou 35 °C; todos os isolados foram capazes de produzir proteases a 25 °C, 72 a 7 °C e 85 a 35 °C. Os resultados obtidos permitiram determinar deficiências higiênicas nas etapas iniciais da cadeia produtiva do leite de cabra, além da relevante participação de micro-organismos psicrotróficos e proteolíticos na microbiota desse produto. A atividade proteolítica de isolados de Pseudomonas spp. de leite de cabra foi caracterizada devido a presença do gene apr e pela atividade proteolítica em diferentes temperaturas de incubação.The application of refrigeration as a tool to preserve the microbiological quality of goat milk during storage and transportation determined the selection of a microbiota typically psychrotrophic in this product. Psychrotrophic microorganisms are potential producers of proteolytic enzymes, usually characterized by being heat resistant and responsible for the deterioration of milk casein even after heat treatments commonlymused at dairies, such as pasteurization and ultra-high-temperature. Pseudomonas spp. are considered the main psychrotrophic and proteolytic microorganisms present in milk. This study aimed to evaluate the microbiological quality of goat milk, obtain autochthonous Pseudomonas spp. isolates of this product and characterize their proteolytic activity. Twelve farms with activity of dairy goat were selected in regions of Muriaé and Viçosa, Minas Gerais, of which 61 samples of goat milk were collected and subjected to microbiological analysis for mesophilic aerobes counts, enterobacteriaceae, total coliforms, Escherichia coli, and proteolytic psychrotrophs, and estimatives of total and proteolytic Pseudomonas. The mean counts obtained for the samples were: 5.04 log CFU/mL for mesophilic aerobes, 3.34 log CFU/mL for enterobacteriaceae, 2.85 log CFU/mL for total coliforms, 0.22 log CFU/ml for E. coli, 3.62 log CFU/mL for total psychrotrophs, 2.73 log CFU/mL for proteolytic psychrotrophs, 3.87 log CFU/mL for Pseudomonas, and 3.43 log CFU/mL for proteolytic Pseudomonas. Although the average of mesophilic aerobes was below the limit recommended by the present Brazilian legislation (5.70 log CFU/mL), the samples of goat milk showed high counts of hygiene indicator microorganisms, which shows inadequate hygienic procedures during the different stages of production and storage. In 22 samples of raw milk the counts of proteolytic psychrotrophs accounted for over 50% of the counts of psychrotrophic, indicating the proteolytic potential of this group in goat milk. The same relationship was observed concerning the presence of proteolytic activity of Pseudomonas spp. which in 27 samples this ratio was greater than 50% of the estimated total counts of Pseudomonas. Considering the plates used for enumeration of Pseudomonas, 496 colonies that showed proteolytic activity were selected, purified and the cultures obtained were subjected to the following tests for preliminary identification:morphology by Gram staining, oxidase and glucose fermentation. Based on these results, 107 isolates were initially identified as Pseudomonas spp., and subjected to rep-PCR to characterize their genetic profiles. Considering similarity rates between 80 and 85%, 33 different genetic profiles were characterized; 36 isolates showed no genetic profile with the rep-PCR protocol used. The isolates were also subjected to PCR for identification in species level with specific primers for P. aeruginosa (38 isolates identified) and P. fluorescens (4 isolates); 61 isolates showed amplification products for both reactions, and 4 for none, and were considered as Pseudomonas spp. based on the laboratory tests during screening. All isolates were subjected to PCR for detection of the apr gene, responsible for encoding the alkaline metalloprotease enzyme, identifying 41 (38.3%) positives. Even isolates that showed no apr gene were capable of producing proteolytic enzymes at 7, 25 or 35 °C; all isolates were able to produce proteases at 25 °C, 72 at 7° and 85 at 35°C. The results made it possible to determine hygienic shortcomings in the initial stages of the production chain of goat milk, besides the relevant participation of psychrotrophic and proteolytic microorganisms in the microbiota of this product. The proteolytic activity of Pseudomonas spp. isolates of goat milk was characterized due to the presence of the apr gene and the proteolytic activity at different incubation temperatures.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio
