Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018The human immunodeficiency virus (HIV) infection and tuberculosis are still major health problems. It is estimated that one third of the human population is latently infected with tuberculosis, with HIV infection being the major risk for reactivation.
Eradication of HIV and Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infections is challenging due to establishment of latent reservoirs, as is the case of macrophages (Mϕ) and dendritic cells (DC), and the emergence of drug resistant strains. This difficulty is aggravated during co-infection. Thus, there is the need to develop and establish an efficient treatment to eradicate these infections.
The long-term goal of this work is the development of a host-directed strategy that, through the manipulation of lysosomal proteases, will boost the host cellular and humoral response against these microorganisms.
In the first part of this thesis we performed a transcriptomic analysis of all cathepsins and their inhibitors cystatins during mono- or co-infections of Mϕ or DC. Upon co-infection with Mtb and HIV, DC and Mϕ have a differential profile of expression being the analysed genes upregulated and downregulated. Further, during co-infections, the gene expression was dominated by the HIV infection.
In the second part we explored the role of cathepsin S and their manipulation as a strategy to control Mtb infection. Study of the involvement of microRNAs, revealed that miR-106b-5p is manipulated by Mtb and that it reduces cathepsin S protein expression. Through loss-of-function experiments, cathepsin S expression, Mtb killing within Mϕ and T cell activation increased. The decrease of Mtb survival was independent of apoptosis, necrosis and autophagy suggesting that miR-106b-5p action on cathepsin S enables Mtb to evade to the degradative activity of enzymes of the endocytic pathway.
These results show a distinct expression profile between HIV Mtb co-infected DC and Mϕ and suggest cathepsin manipulation as a potential target for host directed therapy in Mtb infection.O vírus da imunodeficiência humana (HIV) e a Mycobacterium tuberculosis (Mtb) são os patogenos causadores da síndrome da imunodeficiência adquirida e da tuberculose, respetivamente. É estimado que um terço da população mundial tem tuberculose latente, sendo a infeção por HIV o maior risco para a reactivação da tuberculose latente devido à extensa imunossupressão. A incidência da TB em pessoas infectadas por HIV teve um aumento de 40 % na Europa nos últimos 5 anos, sendo Portugal o terceiro país da Europa com a maior percentagem de pacientes com TB e infetados com HIV.
Embora as doenças causadas por HIV e por Mtb tenham vindo a ser extensivamente estudadas, ainda não existe uma terapia capaz de eliminar estas infeções. Estas dificuldades são causadas em parte pelo aparecimento de estirpes resistentes aos antibióticos/antivirais utilizados e pela existência de reservatórios celulares latentes que contêm estes patogenos num estado de dormência, permitindo que o sistema imune não os ataque nem que estes sejam alvos dos diversos tratamentos. Além disso, quando o mesmo hospedeiro é infetado por HIV e por Mtb a dificuldade em tratar e erradicar ambas as infeções é ainda mais crítica, dado que estes patogenos exacerbaram a infeção um do outro. Deste modo, é necessário desenvolver e estabelecer novos tratamentos de forma a erradicar ou atenuar cada mono-infeção ou co-infeção.
O objetivo deste projeto é o desenvolvimento de uma terapia direcionada ao hospedeiro, através da manipulação de proteases lisossomais, de forma a fortalecer a resposta celular e humoral do hospedeiro contra o HIV e o Mtb durante as mono-infeções e as co-infeções e potencialmente melhorar as terapias existentes. Para tal foi estabelecido um modelo de co-infeção que pretendia assemelhar-se à infeção por Mtb de um indíviduo previamente infectado por HIV e num estado de latência viral. Neste estudo foi também incluído um modelo de co-infeção por HIV-2 e Mtb. Desta forma foi estudada a infeção por HIV-2 que afecta um menor número de indivíduos comparativamente à infeção por HIV-1. Este vírus é também tido como um modelo de HIV com menor virulência.
Numa primeira fase, foi determinada a expressão genética das catepsinas e dos seus inibidores naturais, as cistatinas, durante a mono-infeção por Mtb, HIV-1 e HIV-2 e durante a co-infeção Mtb-HIV em células dendríticas e macrófagos. Numa segunda fase foi determinado se a manipulação da catepsina S por Mtb via microRNAs (miRNAs) contribuía para a sobrevivência intracelular desta bactéria em macrófagos e para o escape à apresentação de antigénios a linfócitos T.
De forma a caracterizar o modelo de infeção estabelecido foi determinada a carga viral e micobacteriana das células assim como a morte celular das mesmas por apototse e necrose. A carga micobacteriana da mono-infeção por Mtb era superior à da co-infeção HIV Mtb em células dendríticas e macrófagos aquando da medição da expressão genética das catepsinas e cistatinas. A morte celular por apoptose e necrose foi também medida e revelou que enquanto as células dendríticas encontram-se maioritariamente num estado inicial de apoptose, os macrófagos apresentam uma maior percentagem de células em fases mais avançadas da apoptose. Em ambos os tipos celulares a necrose ocorre em menos de 1 % das células. Tanto as mono-infeções por HIV-1 e HIV-2 como as co-infeções tiveram um aumento na percentagem de células apoptóticas comparativamente com as mono-infeções com micobactéria, sugerindo que é o efeito do HIV que impera durante as co-infeções.
Neste trabalho foi elucidado o controlo da expressão genética resultante da infeção por Mtb, HIV-1 e HIV-2 durante a mono- e a co-infeção de células apresentadoras de antigénio. As células dendríticas e os macrófagos apresentam uma expressão genética diferencial entre si, observando-se um aumento de expressão geral nas células dendríticas relativamente a macrófagos. O perfil de expressão genética da mono-infeção por HIV-1 e por HIV-2 é idêntico em macrófagos, mas distinto em células dendríticas. Em ambos estes tipos celulares a expressão genética durante a co-infeção foi semelhante à da mono-infeção por HIV-1 e HIV-2. É de notar que as infeções bacterianas apresentam mais diferenças na expressão genética de catepsinas e cistatina durante a infeção de macrófagos. Em contraste, as infeções por HIV-1 e HIV-2 apresentam um maior número de genes diferencialmente expressos durante a infeção de células dendríticas.
O estudo do envolvimento dos microRNAs (miRNA) na modulação da resposta celular do hospedeiro após a infeção por Mtb em Mϕ mostrou que o miR-106b-5p é manipulado por este microrganismo. Sendo que este miRNA tem como alvo a catepsina S, uma das catepsinas que participa na degradação lisossomal do Mtb e na apresentação de antigénios, foi determinado o seu efeito na expressão desta proteína. Os resultados obtidos indicam que o miR-106b-5p reduz a expressão proteica da catepsina S. A manipulação deste miRNA permitiu observar que ao aumentar a sua expressão, a expressão da catepsina S diminui e a sobrevivência intracelular do Mtb aumenta. Em contraste, ao diminuir o miR-106b-5p houve o aumento da expressão da catepsina S e a diminuição da sobrevivência intracelular do Mtb. Foi também demonstrado que a sobrevivência intracelular do Mtb é independente da apoptose, necrose e autofagia o que sugere que a ação do miR-106b-5p na catepsina S permite que o Mtb escape aos enzimas hidrolíticos das vias endocíticas. Ao inferir o impacto da manipulação do miR-106b-5p na apresentação de antigénios e consequentemente na ativação de células T, a inibição deste miRNA levou a um aumento da expressão de moléculas apresentadoras de antigénio à superfície da membrana celular dos Mϕ. Este aumento foi acompanhado por um aumento na ativação de células T após contacto com Mϕ infectados por Mtb.
Estes resultados mostram que existe uma expressão diferencial dos genes das catepsinas e cistatinas entre DC e Mϕ co-infectados com HIV-1 ou HIV-2 e Mtb e que o miR-106b-5p é um potencial alvo para o desenvolvimento de uma terapia direcionada durante a infeção por Mtb.This work was partially financed by ADEIM and by the project FCT PTDC/SAU-INF/28182/201
