Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2012Gamma-aminobutyric acid is the main inhibitory neurotransmitter in central nervous system. To assure a controlled GABAergic transmission GABA must be quickly removed from synapse, which occurs through specific transporters expressed both in pre-synaptic terminal (GAT-1) and surrounding astrocytes (GAT-1 and GAT-3).
Adenosine, which is a well-known neuromodulator, promotes GABA release in the hippocampus (Cunha and Ribeiro, 2000). The main goal of this thesis was to identify a possible role of adenosine upon GABA uptake into pre-synaptic terminals and into astrocytes.
In pre-synaptic terminals, the removal of endogenous adenosine by ADA inhibited GABA uptake, an effect that was mimicked by the
blockade of A2A receptors. Thus, endogenous adenosine, through the activation of A2A receptors, promotes GABA uptake into pre-synaptic terminals. Experiments with activators and inhibitors of transduction pathways revealed that AC/cAMP/PKA is the
transduction pathway associated with this effect. In fact, the activation of PKA restrains an inhibitory tonic influence mediated by PKC, resulting in an increase of GABA uptake. The increase of transport rate occurs through the enhancement of the expression of GAT-1 at the surface membrane.
In astrocytes, adenosine has a biphasic effect upon GABA uptake.
This biphasic effect is mediated by the adenosine A1-A2A receptors heteromers, whose presence in astrocytes was identified in this
work. The adenosine A1-A2A receptor heteromer is coupled to both Gi/0 and Gs protein, being AC/cAMP/PKA the intracellular pathway associated. At low concentration, adenosine activates the A1 protomer, which through Gi/0 protein inhibit AC, decreasing PKA activity and consequently, GABA uptake mediated by both GAT-1 and GAT-3. When adenosine levels rise, adenosine activates
preferentially the A2A protomer, which through Gs activity enhances PKA activity, promoting GABA uptake into astrocytes. The adenosine A1-A2A receptors heteromer can be viewed as a unique entity since it
reaches and leaves the membrane as an entire complex and all the components have to be available for the heteromer be functional.
Moreover, this work clearly showed that the heteromer is associated with both Gs and Gi/0, being a tetramer of A1-A1-A2A-A2A, rather than an A1-A2A complex coupled to Gq as previously thought.
Globally, at tripartite synapse level, adenosine controls the final destination of GABA after its release into the synapse. At low levels, adenosine will inhibit uptake into astrocytes but promote the uptake of GABA into presynaptic terminals, therefore facilitating the inhibitory phasic and tonic transmission. At higher levels of adenosine, GABA uptake into astrocytes will be favoured, which may decrease GABAergic tonic transmission, therefore facilitating
excitability. In conclusion, this work highlighted a yet unknown mechanism through which adenosine may contribute to the switch
between inhibition and excitation, through a concerted cross-talk between astrocytes and inhibitory neurons.O ácido gama-aminobutírico (GABA) é o principal neurotransmissor
inibitório do Sistema Nervoso Central (SNC). Uma vez na sinapse o
GABA é rapidamente recaptado através de transportadores
específicos expressos pelos neurónios mas também pelas células da
glia, que envolvem a sinapse.
A rápida recaptação de GABA pelos transportadores permite um
controlo adequado dos níveis de GABA na sinapse, o que é
fundamental para a limitação temporal e espacial da transmissão
inibitória. Este controlo é assegurado por transportadores
específicos expressos no terminal pré-sináptico e nos astrócitos que
envolvem a sinapse. Actualmente são conhecidos quatro
transportadores de GABA: três de alta afinidade (GAT-1, GAT-2, GAT-
3) e um de baixa afinidade (BGT-1). O GAT-1 é o principal
transportador de GABA, sendo expresso pelos neurónios e também
pelas células da glia. Por sua vez, O GAT-3 é o principal
transportador das células gliais. Em conjunto, estes dois
transportadores são os responsáveis pela recaptação de GABA nas
sinapses do sistema nervoso central.
A adenosina é um conhecido neuromodulador, que desempenha, ao
nível do sistema nervoso central, um vasto leque de acções, que
resulta numa inibição tónica do SNC. De entre as funções
desempenhadas, a adenosina modula a concentração de
neurotransmissores da sinapse, regulando quer a sua libertação
vesicular quer a sua recaptação por transportadores. A adenosina exerce as suas acções através de receptores acoplados
a proteínas G. Até ao momento foram identificados quatro subtipos
diferentes de receptores: dois de alta afinidade (A1 e A2A) e dois de
baixa afinidade (A2B e A3). Os receptores A1 e A3 são receptores
inibitórios, estando classicamente acoplados a proteínas Gi/0. Por seu
lado, os receptores do subtipo A2 são receptores excitatórios,
estando geralmente acoplados a proteínas Gs.
Tendo como ponto de partida o efeito modulador da adenosina
através da activação dos receptores A2A, sobre libertação de GABA
no hipocampo (Cunha e Ribeiro, 2000), este trabalho teve como
principal objectivo a identificação de um possível efeito modulador
da adenosina sobre a recaptação de GABA para os terminais présinápticos
e também para os astrócitos, através dos transportadores
GAT-1 e GAT-3.
Os resultados obtidos neste trabalham indicam claramente que a
adenosina através da activação dos receptores A2A promove a
recaptação de [3H]GABA para os terminais pré-sinápticos mediada
pelo transportador GAT-1. Com o objectivo de determinar o efeito
da adenosina endógena, os terminais pré-sinápticos (sinaptossomas)
foram incubados com adenosina desaminase (ADA, 1U/ml), tendo
sido observada uma diminuição da recaptação de [3H]GABA. A ADA
degrada a adenosina em inosina, um metabolito inactivo para os
receptores de adenosina, permitindo assim inferir o efeito da
adenosina endógena. O efeito inibitório causado pela remoção da
adenosina endógena foi mimetizado pelo bloqueio dos receptores
A2A com o antagonista selectivo SCH 58261 (50 nM). O envolvimento dos receptores A2A foi ainda confirmado através do uso do agonista
selectivo destes receptores (CGS 21680, 30 nM): a activação dos
receptores A2A pelo CGS 21680 promoveu a recaptação de
[3H]GABA, mediada pelo transportador GAT-1.
O envolvimento de outros subtipos de receptores de adenosina,
especificamente os subtipos A1 e A2B, foi avaliado através do uso de
agonistas e antagonistas selectivos. Tanto a activação como o
bloqueio dos receptores A1 ou A2B não causaram qualquer efeito
sobre a recaptação de [3H]GABA mediada por GAT-1 em
sinaptossomas.
Ensaios de biotinilação, realizados após incubação dos
sinaptossomas com o agonista selectivo dos receptores A2A,
mostraram que o efeito excitatório da adenosina sobre a recaptação
de [3H]GABA ocorre através do aumento do número de
transportadores GAT-1 na membrana celular. Este efeito foi
confirmado por curvas de saturação do transportador GAT-1, que
mostraram um aumento da velocidade máxima do transportador
após incubação com o agonista selectivo dos receptores A2A, o que é
indicativo de um aumento do número de transportadores GAT-1 na
membrana celular.
A via de transdução de sinal associada ao efeito dos receptores A2A
foi identificada através de ensaios de recaptação realizados na
presença de bloqueadores e activadores de cinases intracelulares. O
bloqueio da proteína cinase do tipo A (PKA) pelo H-89 (1mM)
preveniu totalmente o efeito do CGS 21680, enquanto a activação
da adenilato ciclase (AC) pela forskolin (10mM) imitou a acção do agonista selectivo dos receptores A2A. Assim, os resultados indicam
que a adenosina, por activação dos receptores A2A promove a
recaptação de [3H]GABA mediada por GAT-1, através da activação da
via da PKA.
Foi ainda testado o envolvimento da via de sinalização mediada pela
proteína cinase do tipo C (PKC). O bloqueio da PKC pelo GF109203X
(1mM) promoveu a recaptação de [3H]GABA mediada por GAT-1. Em
concordância, a activação da PKC por ésteres de forbol (12,13-
didecanoato de forbol – PDD 250nM) inibiu a recaptação de
[3H]GABA mediada por GAT-1, indicando que a PKC está
endogenamente a inibir o transporte de [3H]GABA para os terminais
pré-sinápticos.
Estes resultados sugerem assim, o envolvimento das duas vias de
sinalização na recaptação de [3H]GABA mediada por GAT-1. Estudos
de recaptação realizados com diferentes combinações de
activadores e bloqueadores de ambas as proteínas cinases indicam
que a activação dos receptores A2A da adenosina, com consequente
activação da PKA, restringe o efeito tónico inibitório da PKC sobre o
transporte de [3H]GABA, o que resulta numa potenciação da
recaptação de GABA através do transportador GAT- 1 para o
terminal pré-sináptico, por aumento do número de transportadores
presentes na membrana celular.
O estudo de recaptação de [3H]GABA em astrócitos sugere a
existência de um efeito bifásico mediado pela adenosina sobre os
transportadores GAT-1 e GAT-3. A incubação de culturas primárias
de astrócitos com cloroadenosina (CADO), um análogo nãoxxxiii
metabolizável da adenosina teve um efeito bifásico sobre o
transporte: a baixas concentrações (0,3μM), a CADO inibiu o
transporte enquanto que concentrações mais elevadas (3 e 10 μM)
de CADO promoveram a recaptação de [3H]GABA.
Por outro lado, a remoção de adenosina endógena pela acção da
adenosina desaminase (ADA, 1U/ml) diminuiu a recaptação de
[3H]GABA mediada por GAT-1 e por GAT-3, sugerindo que as
concentrações de adenosina endógena presentes na cultura de
astrócitos promovem o transporte de [3H]GABA.
A realização de ensaios de recaptação com fármacos selectivos para
os receptores de adenosina permitiu a identificação dos receptores
envolvidos. Assim, o agonista selectivo dos receptores A2A (CGS
21680, 30nM) promoveu a recaptação de [3H]GABA mediada por
GAT-1 e GAT-3. Surpreendentemente, este efeito para além de ter
sido bloqueado pelo antagonista selectivo dos receptores A2A (SCH
58261, 50nM) foi também prevenido pelo bloqueio dos receptores
A1 com o antagonista selectivo DPCPX (50nM). Por seu lado, a
activação dos receptores A1 com o agonista selectivo CPA (30nM)
levou à diminuição da recaptação de [3H]GABA mediada por GAT-1 e
por GAT-3. Este efeito foi bloqueado quer pelo antagonista dos
receptores A1 quer pelo antagonista dos receptores A2A. Estes
resultados sugerem a existência de uma interacção entre os
receptores A1 e A2A da adenosina nos astrócitos. De facto, a
existência de uma interacção entre os receptores A1 e A2A da
adenosina é conhecida desde há bastante tempo, tendo sido
descrita inicialmente no hipocampo (Cunha et al., 1994; Lopes et al., 1999) e na junção neuromuscular (Correia-de-Sá e Ribeiro, 1994). A
natureza desta interacção era desconhecida até 2006, quando se
identificou a ocorrência de heterómeros de receptores da adenosina
A1-A2A em células imortalizadas transfectadas (Ciruela et al., 2006),
através de ensaios de bioluminesce ressonance energy transfer
(BRET). Recorrendo a esta tecnologia, bem como a ensaios de
ligação, identificou-se neste estudo, pela primeira vez, a presença de
heterómeros de receptores de adenosina A1-A2A nos astrócitos. O
estudo reportado nesta dissertação foi pois o primeiro a identificar
inequivocamente a presença de heterómeros A1-A2A em células não
imortalizadas.
A identificação do subtipo de proteínas G acopladas ao heterómero
de receptores de adenosina A1-A2A foi realizada através de ensaios
de ligação de [35S]GTPgS acoplados a imunoprecipitação e de ensaios
de recaptação realizados na presença de toxinas que bloqueiam
selectivamente a actividade das proteínas Gs e Gi/0. Os ensaios
realizados indicam claramente que os heterómeros de receptores da
adenosina A1-A2A estão acoplados a ambas as proteínas Gs e Gi/0, e
não a uma única proteína Gq, como inicialmente se supunha, com
base no que ocorre na heteromerização dos receptors da dopamina.
O trabalho descrito nesta dissertação demonstrou ainda que o
heterómero de receptores de adenosina A1-A2A é na verdade um
tetrâmero formado por dois receptores A1 e dois receptores A2A (A1-
A1-A2A-A2A), o que permite o acoplamento de duas proteínas G
diferentes. Ensaios de recaptação de [3H]GABA realizados na presença do
activador da AC, forskolin, e do inibidor competitivo da PKA, RpcAMPs,
sugerem que o heterómero de receptores de adenosina A1-
A2A sinaliza através da via AC/cAMP/PKA. O presente estudo
permitiu ainda concluir que os heterómeros de receptores da
adenosina A1-A2A funcionam como uma única entidade, que para ser
funcional, necessita que todos os componentes estejam disponíveis
para activação. Assim se entende que o bloqueio do receptor A1 ou
da proteína Gi/0 previna o efeito mediado pela activação dos
receptores A2A, bem como o bloqueio dos receptores A2A ou da
proteína Gs previna o efeito inibitório mediado pelos receptores A1.
Assim, nos astrócitos, o efeito bifásico da adenosina sobre a
recaptação de [3H]GABA é mediado pela activação dos heterómeros
de receptores da adenosina A1-A2A. A baixa concentração, a
adenosina activa preferencialmente os receptores A1, levando à
activação de proteínas Gi/0, que, por inibição da actividade da AC,
provocam a redução dos níveis de cAMP, inibindo a PKA e
reduzindo, consequentemente, a recaptação de GABA mediada por
GAT-1 e GAT-3. Por outro lado, em concentrações superiores, a
adenosina através da activação dos receptores A2A, e consequente
activação de proteínas Gs, por activação da AC, eleva os níveis de
cAMP, o que promove a actividade da PKA, e aumenta o transporte
de GABA mediada por GAT-1 e GAT-3 em astrócitos.
Considerando a sinapse tripartida, os resultados sugerem que em
baixas concentrações a adenosina conduz preferencialmente o
GABA para o terminal pré-sináptico, favorecendo portanto a transmissão fásica inibitória e impedindo o esgotamento das
reservas pré-sinápticas. Em concentrações mais elevadas, a
adenosina aumenta a recaptação de GABA pelos astrócitos, o que
deverá diminuir a inibição tónica e permitir o aumento da
excitabilidade. Assim, através da modulação dos transportadores de
GABA, a adenosina pode ser considerada como um agente
amplificador do tónus GABAérgico. Quando o tónus inibitório é
prevalente, a adenosina direcciona a recaptação de GABA para os
terminais pré-sinápticos, facilitando a transmissão fásica inibitória.
Pelo contrário, a facilitação da recaptação de GABA pelos astrócitos
reduz a inibição tónica, favorecendo a transmissão excitatória.
Em suma, este trabalho revela um mecanismo até agora
desconhecido, através do qual a adenosina pode contribuir para a
transição entre uma situação inibitória e outra excitatória,
fenómeno que envolve a interacção entre astrócitos e neurónios
inibitórios
