寡聚核苷酸及其衍生物能选择性调节基因表达。在反义技术中 ,寡聚核苷酸可以mRNA的专一序列或双链DNA的特定序列为靶点 ,阻止遗传信息向蛋白质的流动 ;也可与双螺旋DNA专一序列结合形成三链DNA ,阻止基因转录或DNA复制。反基因寡聚核苷酸以其独特的结构和优于反义RNA的技术特点 ,为恶性肿瘤的治疗提供了新的途径

李祺福

欧阳高亮

田长海

Xiamen University Institutional Repository

肿瘤反基因治疗研究进展田长海 ,李祺福 ,欧阳高亮综述 　洪水根审校(厦门大学生命科学学院细胞生物学研究室 ,福建 　厦门 　361005)摘要 :寡聚核苷酸及其衍生物能选择性调节基因表达。在反义技术中 ,寡聚核苷酸可以 mRNA 的专一序列或双链 DNA的特定序列为靶点 ,阻止遗传信息向蛋白质的流动 ;也可与双螺旋 DNA 专一序列结合形成三链 DNA ,阻止基因转录或 DNA复制。反基因寡聚核苷酸以其独特的结构和优于反义 RNA 的技术特点 ,为恶性肿瘤的治疗提供了新的途径。关键词 :三链 DNA ;反基因 ;基因治疗 ;肿瘤中图分类号 :R730. 5 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :100028225 (2001) 0420274203作者简介 :田长海 (19742) ,男 ,安徽亳州市人 ,硕士生 ,研究方向为肿瘤细胞生物学。　　肿瘤的发生是一个多因素参与、多基因协同作用的多阶段过程。传统的肿瘤手术治疗、化疗和放疗因其自身的局限性 ,使其应用的范围无法扩大。随着分子生物学各项技术的日趋成熟 ,基因治疗作为肿瘤治疗的一个新靶点 ,日益受到人们的重视。基因治疗是指将目的基因导入靶细胞和宿主的体内 ,通过基因的整合成为宿主遗传物质的一部分 ,纠正错误的基因表达和基因表达的错误 ,以达到治疗的目的。自 1990 年美国科学家首次完成了 1 例联合免疫缺陷综合征的基因治疗并取得较好的疗效以来 ,肿瘤的基因治疗研究已成为目前肿瘤防治研究的一个活跃的领域[1 ,2 ] 。随着人们对肿瘤免疫、肿瘤发生发展的分子机制和细胞增殖、分化及其调控规律的深入研究 ,肿瘤的基因治疗研究获得巨大推动力。目前 ,人们已经开展了肿瘤的免疫基因治疗[3 ,4 ] 、自杀基因的靶向化疗[5 ,6 ]和以抗体为基础的基因治疗[7 ,8 ] 以及肿瘤治疗的反义技术[9 ,10 ,11 ]等具有广阔发展前景的肿瘤基因治疗的研究。1980 年 Cline 用重组β2珠蛋白基因治疗 2 例地中海贫血症的患者 ,以此为契机基因治疗取得了迅速的发展。但在取得成就的同时 ,基因治疗也暴露了一些问题。安全方面的风险及转基因表达的不稳定性使基因替代疗法远未达到人们最初的预想效果。在现阶段 ,反义疗法可能是较好的方向 ,因为反义核酸具有传统药物的使用方便和容易大量生产等优点 ,同时它又比传统药物有着更高的作用特异性。近年来刚刚发展起来的反基因技术比反义 RNA 治疗更进一步 ,它是通过寡聚核苷酸片段与双链 DNA 结合形成局部的三链结构来抑制基因的转录 ,从而调控基因的表达。由于遗传信息从 DNA 流向 RNA 是一个遗传信息放大的过程 ,而反基因技术是在转录水平发挥作用的 ,因而较反义 RNA 疗法更有效。本文就反基因技术中三链 DNA的结构、反基因寡聚核苷酸作为抗肿瘤药物的作用机制及可行性以及在肿瘤基因治疗中的应用作一概述。1 　三螺旋 DNA的结构早在 1953 年 Pauling 和 Corey 就提出了三螺旋核酸的结构模型 ,1957 年Davies 等在研究 poly[ rA]和 poly[ rU] 的相互作用时 , 发现它们能形成一种三螺旋RNApoly[ rA]·2poly[ rU ] ,并首次基于实验结果提出了三螺旋核酸的概念。60 年代初 Lipsett 和 Howard 先后报道了质子化 poly[ rC]和 poly[ rG]·poly[ rC]双螺旋能发生相互作用而形成三螺旋DNA 结构。70 年代初期 ,Arrnott 等根据 X射线衍射的结果 ,建立了三螺旋核酸分子的简单模型。80 年代 ,人们发现在真核细胞染色质中 ,许多基因的调节区和染色质重组的敏感部位都具有对 S1 核酸酶等单链特异性核酸内切酶高度敏感的位点。分析这些位点的 DNA 序列 ,发现它们通常都含有对应重复同型嘌呤2同型嘧啶序列。将人工合成的这种序列插入到负超螺旋质粒的 DNA 中 ,结果与在染色质中一样 ,它们对 S1 核酸内切酶也高度敏感。1987 年 Mrikin 等将一段含有对应序列 (称为 H2回文序列)的 Pu·Py 区段插入到质粒 DNA 中 ,构建成人工质粒 ,发现在酸性条件下可通过链的自身回折形成一种质子化的三螺旋 DNA (称 H2DNA) 。Gowers 等[12 ,13 ]通过实验证实了 DNA 三螺旋在含有很多吡啶间隔的靶位点能形成并通过胞嘧啶的质子化进行稳定的三螺旋结构。与双螺旋 DNA 不同 ,三螺旋 DNA 的组成结构单元是三碱基体 ,它有两种基本类型 :一种是嘧啶2嘌呤2嘧啶型三碱基体 ,如 T·AT 和 C+ ·GC ;另一种则是嘌呤2嘌呤2嘧啶三碱基体 ,如 G·GC 和 A·AT 等 ,这些三碱基体的形成具有专一性 ,具体体现在 T(A) 和 C+( G)分别要与 Watson2Crick 碱基对通过 Hoogsteen 氢键结合。另外 ,最近研制的一种对核酸酶的稳定性和膜透性都有所提高的新型 DNA 模拟物肽核酸 (peptide·472· 国外医学肿瘤学分册 　2001 年 8 月 　第 28 卷 　第 4 期nucleic acid ,PNA) ,它是一种以 22氨基乙基甘氨酸为基本单元的多肽核酸 ,可以通过一个甲基羰基把碱基与类肽链骨架相连 ,它与 DNA 及 RNA 之间除了 Watson2Crick 配对外 ,还可以通过 Hoogsteen 配对形成 PNA2DNA(RNA)2PNA 的三链结构。PNA 与互补的 DNA 或RNA 结合具有高度的专一性 ,具备与靶基因形成二聚体的能力。PNA 与 DNA 或 RNA 结合形成稳定的 Wat2son2Crick 键 ,其亲和力较相应的 DNA 和 RNA 之间的高 ,PNA 与DNA 杂交 Tm 值同相应的DNA2DNA 杂交复合物相比 ,每碱基对的 Tm 值至少升高 1 ℃。这种稳定性增加是由于 PNA2DNA 的中性骨架之间排斥力小及空间结构易于配对所致。进一步的研究表明 , PNA2RNA杂交 Tm 值较 PNA2DNA 杂交值高 ,而且同 PNA2DNA 双链相比 ,PNA2RNA 双链结合速率更快 ,解离速度相对较慢[14 ] 。因此 , PNA 与相同序列的 DNA、RNA和 PNA 杂交稳定性依次为 PNA2PNA、PNA2RNA、PNA2DNA、DNA2DNA。由于 PNA 比反义 RNA 具有更强的亲和力及更好的特异性 ,更短的片段即可获得相同的反义效果 ,并且具有良好的蛋白酶和核酶抗性 ,半衰期长。因而把它作为反基因治疗肿瘤的药物具有更加广阔的应用前景。三螺旋 DNA 结构形成的特异性和选择性为开发高效安全的肿瘤反基因药物提供了理论依据。1988年 Cooney 等首先证实了这一设想 ,他们根据 c2myc 基因的 P1 (promoter1) 启动子区的序列 ,以 R·RY型配对方式合成了一段 27bp 的能形成三链结构的寡聚核苷酸序列 ,通过电泳迁移分析和 DNaseI 印迹实验显示了其能与靶序列结合并形成稳定的双螺旋结构。体外转录系统中 ,寡聚核苷酸能特异地抑制 c2myc 基因的转录 ,不能结合的寡聚核苷酸对靶序列的 mRNA 水平无影响 ,这一实验的成功标志着肿瘤基因治疗中一种新技术的诞生。2 　反基因寡脱氧核糖核苷酸作为抗肿瘤药物的作用机制反基因寡脱氧核糖核苷酸 (oligdeoxyribonucleoti2des ,ODN)的作用机制是在 DNA 结合蛋白 (如甲基化酶、激活子、限制性内切酶等) 的识别位点处 ,ODN 通过与该靶基因结合形成三螺旋 ,而位点专一性地干扰DNA 和蛋白质的结合、激活子的转录起始或转录延伸等 ,进而阻止基因转录和复制。另外 ,通过对反基因ODN 进行化学改性 (如在 ODN 的 3′2末端连接上化学切割试剂 :乙二胺四乙酸、二价铁离子或邻菲罗啉的衍生物等 ,后者需要铜离子和还原剂的存在) ,可实现对靶基因进行诱导切割等不可逆的反应[15 ] ,从而导致靶基因的失活。由此可见 ,反基因 ODN 作为药物其作用的机制简单 ,这也就为其发展为抗肿瘤药物提供了可能性。首先 ,反基因 ODN 与靶 DNA 双螺旋形成三链状结构的先决条件是对导致肿瘤发生的某些致病基因所需要的编码蛋白基因的部分或全部核苷酸序列的了解 ,任何由基因或基因组表达所引起的疾病都有可能作为三链 DNA 技术的应用对象。人类基因组计划的迅速进展 ,将使人们对自身基因组的基因序列以及功能信息有较为全面的了解 ,特别是对某些致病基因结构和功能的认识 ,为开发针对性强、选择性好的新一代抗肿瘤药物创造了条件。其次 ,反基因 ODN 的化学改性作用 ,克服了细胞内限制性内切酶对未改性 ODN 的快速水解作用 ,延长了反基因 ODN 在细胞内的半衰期。目前化学改性主要采用甲基化磷酸、硫酸磷酸酯和磷酰胺类似物代替硫酸二酯键的骨架 ,其中采用最多的是硫化磷酸酯替代物。另外 ,反基因 ODN 的 3′末端和 5′末端可以采用各种封端基团来改性。Ryan等[16 ]在实验中发现能形成三链结构的环状寡聚核苷酸 ,能够以一种现有人工合成配体所不具备的拓扑行为结合到 DNA 的双螺旋结构上 ,这为以 DNA 双螺旋为靶点 ,发展特异性基因治疗和诊断试剂又提供了新的切入点。3 　反基因技术在肿瘤基因治疗中的应用肿瘤是细胞原癌基因的激活和 (或)抑癌基因的缺失或改变等多种因素共同作用所致 ,利用反基因技术设计出与突变基因、非正常表达的基因等互补的寡核苷酸序列 ,使它们能够与靶 DNA 双链形成三链状结构 ,封闭目的基因 ,使其不能正常表达 ,为肿瘤的治疗提供了新的方向。1988 年 ,Cooney 等用癌基因 c2myc进行研究 ,设计在基因的控制区上构建能形成三螺旋体的寡聚核苷酸片段可以抑制信使 RNA 合成的启动 ,阻止遗传信息的放大。并对寡核苷酸片段进行无细胞转录鉴定 ,将该基因和寡聚核苷酸与试管中的各种细胞成分混合在一起 ,而不是与完整的细胞混合 ,得到的结果是一致的。随后 ,Dervan 再度用无细胞体系证实三螺旋结构的形成能够阻止目的基因的转录。随着人类基因组计划取得突破性的进展 ,新的致病基因的基因草图的完成及其功能的鉴定 ,人们就可以按照自己的意图设计出能与致癌基因形成三链状结构的寡聚核苷酸片段 ,使其能准确地寻找目的基因控制区 ,并选择性地阻止其转录成 mRNA ,以达到阻止基因表达的目的。研究表明 ,针对基因编码区的反基因药物能够阻止 RNA 聚合酶构建 mRNA 转录本。这暗示着当反基因药物不能阻止转录启动时 ,它可能在中游切断转录。Hélène 等已经证实 ,针对编码白细胞介素22 ( IL22)受体基因控制区的寡聚核苷酸能够抑制该·572·国外医学肿瘤学分册 　2001 年 8 月 　第 28 卷 　第 4 期基因的表达。Postel 等设计针对人 c2myc 基因调节区的寡聚核苷酸 ,能够抑制人肿瘤细胞多种癌基因的转录。许多研究表明 ,寡聚核苷酸能够降低活细胞中多种癌基因的转录。目前已经对原癌基因 Ki2ras、C2pim21、HER、Ha2ras、c2myc 等的启动子内分子间三链 DNA的形成进行研究 ,其中以对 c2myc 基因的研究最为深入 ,结果表明反基因 ODN 不仅能在体外转录体系中抑制 c2myc 基因的转录[16 ] ,而且还可通过形成特异三螺旋结构 ,在 Hela 细胞内同样能够阻止 c2myc 基因的转录[17 ] 。Thomas 等[18 ] 在研究 MCF27 乳腺癌细胞时发现 ,形成三链 DNA 的寡聚核苷酸片段能够特异性地抑制原癌基因 c2myc 的表达。另外 ,人多药耐药基因mdr1 编码一种跨膜糖蛋白 ,其高效表达与肿瘤细胞的耐药有关 ,从而降低了肿瘤化疗治疗的效果。Scaggiant等[19 ]以 mdr1 编码区内的一段 27bp 的同聚嘌呤·同聚嘧啶片段为靶序列 ,经实验证实低浓度的反义寡聚核苷酸片段可以通过形成三链状结构明显抑制 mdr1mRNA 的合成。因此 ,以形成三链结构为基础的反基因技术可以作为肿瘤化疗的辅助疗法 ,以增强化疗的效果 ,并减少毒副作用。4 　问题及前景反基因技术在肿瘤基因治疗中显示出了诱人的应用前景 ,但反基因 ODN 自身的稳定性问题尚未最终解决 ,故其应用目前尚处于实验阶段。另外 ,反基因ODN 必须与同聚嘌呤·同聚嘧啶片段结合 ,但这样的DNA 片段在真核细胞中很少 ,因此很难有足够大的浓度与靶基因的部分或全部序列结合 ,彻底在转录水平上阻断 mRNA 的转录。尽管反基因技术存在着某些问题 ,但是随着人们对细胞解链及编辑 RNA 进化机制的阐述、计算机辅助药物设计及生物芯片技术和人类基因组计划的发展 ,将给反基因技术在肿瘤治疗中的应用带来广阔前景。参考文献[ 1 ] 　Zwacka RM ,Dunlop MG . Gene therapy for colon cancer[J ] . Hematol On2col Clin North Am ,1998 , 12 (3) :5952615 .[2 ] 　Gore ME , Collins MK . Gene therapy for cancer [J ] . Eur J cancer ,1994 , 30A(8) : 10472 1049 .[3 ] 　Tahara H , Lotze MT . Antitumor effects of interleukin212 ( IL212) :appli2cations for the immunotherapy and gene therapy of cancer[J ] . Gene Ther ,1995 , 2 (2 ) : 962106 .[4 ] 　Armstrong CA , Botella R , Galloway TH , et al . Antitumor effects ofgranulocyte2macrophage colony2stimulating factor production by melanomacells[J ] . Cancer Res , 1996 , 56 (9) : 219122198 .[ 5 ] 　Kanai F , Lan KH , Shiratori Y, et al . In vivo gene therapy forα2fetopro2tein2producing hepatocellular carcinoma by adenovirus2mediated transfer ofcytosine deaminase Gene[J ] . Cancer Res ,1997 ,57 (3) :4612465.[ 6 ] 　Lechanteur C , Princen F , Lo Bue S , et al . HSV21 thymidine kinase genetherapy for peritoneal carcinomatosis [J ] . Adv Exp Med Biol , 1998 ,451 :1152119.[ 7 ] 　Foster BJ , Kern JA . HER22targeted gene transfer[J ] . Hum Gene Ther ,1997 ,8 (6) :7192727.[8 ] 　Cochet O , Kenigsberg M ,Delumeau I , et al . Intracellular expression of anantibody fragment2neutralizing p21 Ras promotes tumor regression [ J ] .Cancer Res , 1998 ,58 (6) :117021176 .[9 ] 　Citro G, D’Agnano I , Leonetti C , et al . c2myc antisense oligodeoxynu2cleotides enhance the efficacy of cisplatin in melanoma chemotherapy in vi2vo and in nude mice[J ] . Cancer Res , 1998 ,58 (2) :2832289.[10 ] 　Guha C , Guha U , Tribius S , et al . Antisense ATM gene therapy : astrategy to increase the radiosensitivity of human tumors[J ] . Gene Ther ,2000 , 7 (10) : 8522858 .[11 ] 　Raizada MK , Francis SC , Wang HW , et al . Targeting of the renin2angiotensin system by antisense gene therapy : a possible strategy for thelong2term control of hypertension[J ] . J Hypertens ,2000 ,18 (4) :3532362.[12 ] 　Gowers DM , Bijapur J , Brown T , et al . DNA triple helix formation attarget sites containing several pyrimidine interruptions : Stabilization byprotonated cytosine or 52(12propargylamino) dU[J ] . Biochemistry , 1999, 38 (41) : 13747213758 .[13 ] 　Gowers DM , Fox KR . DNA triple helix formation at oligopurine sitescontaining multiple contiguous pyrimidines [ J ] . Nucleic Acids Res ,1997 , 25 (19) :378723794 .[14 ] 　Jensen KK, Orum H , Nielsen PE , et al . Kinetics for hybridization ofpeptide nucleic acids(PNA) with DNA and RNA studied with the biacoretechnique[J ] . Biochemistry , 1997 ,36 (16) : 507225077.[ 15 ] 　Shimizu M , Inoue H , Ohtsuka E , et al . Detailed study of sequence2spe2cific DNA cleavage of triplex2forming oligonucleotides linked to 1 , 102phenanthroline[J ] . Biochemistry , 1994 ,33 (2) :6062613.[16 ] 　Ryan K , Kool ET . Triplex2directed self2assembly of an artificial slidingclamp on duplex DNA[J ] . Chem Biol ,1998 ,5 (2) :59267.[17 ] 　Postel EH , Flint SJ , Kessler DJ , et al . Evidence that a triplex2form2ing oligodeoxyribo2nucleotide binds to the c2myc promoter in Hela cells ,thereby reducing c2myc mRNA levels [J ] . Proc Natl Acad Sci USA ,1991 ,88 (18) :822728231.[18 ] 　Thomas TJ , Faaland CA , Gallo MA , et al . Suppression of c2myconcogene expression by a polyamine2complexed triplex forming oligonu2cleotide in MCF27 breast cancer cells [J ] . Nucleic Acids Res ,1995 ,23(17) :359423599.[19 ] 　Scaggiante B , Morassutti C , Tolazzi G , et al . Effect of unmodifiedtriple helix2forming oligodeoxyribonucleotide targeted to human multidrug2resistance gene mdr1 in MDR cancer cells [J ] . FEBS Lett ,1994 ,352(3) :3802384.(收稿日期 :2000210228 　修回日期 :2001203208)·672· 国外医学肿瘤学分册 　2001 年 8 月 　第 28 卷 　第 4 期

肿瘤反基因治疗研究进展

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/154245/%e8%82%bf%e7%98%a4%e5%8f%8d%e5%9f%ba%e5%9b%a0%e6%b2%bb%e7%96%97%e7%a0%94%e7%a9%b6%e8%bf%9b%e5%b1%95.pdf?sequence=1&isAllowed=y

肿瘤反基因治疗研究进展

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Xiamen University Institutional Repository