乙醇是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HP1厌氧发酵产H2的主要副产物,每生成1.0 mol的乙醇需要消耗2.0 mol NAD(P)H,从而降低了H2的产量.本研究以编码乙醇脱氢酶系(含乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶活性)的adhE基因为改造目标,利用同源重组技术获得了以提高产氢为目标的K.oxytoca重组菌.构建工作包括:根据adhE基因保守序列框克隆K.oxytoca HP1 adhE基因片段,以质粒pMHE6为模板进行链霉素抗性基因表达盒的扩增,表达链霉素抗性的aadA基因片段和adhE基因片段分别与载体pMD18-T相连构建重组质粒,同源整合质粒pTA-Str的构建,以链霉素作为筛选标记筛选重组菌.菌落PCR鉴定结果表明,aadA基因表达盒通过质粒pTA-Str的介导已定点插入K.oxytoca HP1基因组中,成功地构建了adhE基因部分片段缺失的重组菌.葡萄糖发酵实验结果表明,相同发酵条件下,重组菌比野生菌的产氢量提高了16.07%,乙醇产量下降了70.47%.利用基因工程技术提高产氢初步获得成功.国家自然科学基金(批准号:30470395);; 福建省重点科技项目(批准号:2005I106

徐惠娟

徐方成

朱俊波

邬小兵

龙敏南

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       论 文  第 52卷 第 1期  2007年 1月   www.scichina.com  55 Klebsiella oxytoca HP1 adhE基因插入失活法 构建产氢重组菌 朱俊波①  龙敏南②  徐方成①*  邬小兵②  徐惠娟②  (① 厦门大学化学化工学院化学工程与生物工程系, 厦门 361005; ② 厦门大学生命科学学院, 厦门大学生物能源中心, 厦门 361005.  * 联系人, E-mail: fcxu@xmu.edu.cn) 摘要  乙醇是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HP1厌氧发酵产 H2的主要副产物, 每生成 1.0 mol的乙醇需要消耗 2.0 mol NAD(P)H, 从而降低了 H2的产量. 本研究以编码乙醇脱氢酶系(含乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶活性)的 adhE基因为改造目标, 利用同源重组技术获得了以提高产氢为目标的 K. oxytoca重组菌. 构建工作包括: 根据 adhE基因保守序列框克隆 K. oxytoca HP1 adhE基因片段, 以质粒 pMHE6为模板进行链霉素抗性基因表达盒的扩增, 表达链霉素抗性的 aadA 基因片段和 adhE 基因片段分别与载体 pMD18-T相连构建重组质粒, 同源整合质粒 pTA-Str的构建, 以链霉素作为筛选标记筛选重组菌. 菌落PCR鉴定结果表明, aadA基因表达盒通过质粒 pTA-Str的介导已定点插入K. oxytoca HP1基因组中, 成功地构建了 adhE 基因部分片段缺失的重组菌. 葡萄糖发酵实验结果表明, 相同发酵条件下, 重组菌比野生菌的产氢量提高了 16.07%, 乙醇产量下降了 70.47%. 利用基因工程技术提高产氢初步获得成功.  关键词  Klebsiella oxytoca HP1  adhE基因  发酵产氢  基因插入失活                         2006-10-30收稿, 2006-12-07接受 国家自然科学基金(批准号: 30470395)和福建省重点科技项目(批准号: 2005I106)资助 随着国际石油价格的一路飙升 , 化石燃料日趋枯竭的问题已成为人们关注的焦点 . 而且这类燃料燃烧产生的 CO2, SO2等有害物质又会给地球带来温室效应和酸雨等不良后果 , 引起严重的环境污染问题[1]. 因此, 寻找替代能源、开发洁净的新能源和可再生能源是社会发展的必然趋势. 在诸多新型替代能源中, 氢能被认为是最有吸引力的替代能源之一[2]. 在产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HP1厌氧发酵产氢过程中 ,  乙醇的生成消耗了大量的NAD(P)H, 这可能是导致了氢气得率降低的原因之一[3,4]. 细菌厌氧发酵产乙醇的过程是一个两步酶促反应: 第一步, 由与CoA偶联的乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH)催化乙酰 CoA生成乙醛; 第二步, 由 Fe2+依赖的乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADH)催化乙醛生成乙醇[5]. 这两个酶的活性都是来源于 adhE 基因表达的乙醇脱氢酶系, 即这两个酶实际上是由同一个基因 adhE 编码的 (h t tp : / /www. ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NP_415757.1). 因此, 通过插入失活的方法阻断 adhE 基因的表达, 可阻断乙醇代谢途径, 使 K. oxytoca HP1代谢过程中 产生的过量 NAD(P)H 流向产氢途径, 从而提高产氢量. 本研究首先通过 adhE 基因的保守序列框设计引物克隆得到 K. oxytoca HP1 adhE 基因的部分片段, 然后在 adhE基因中插入氨基葡萄糖苷腺苷转移酶基因(aadA), 利用同源重组技术构建 adhE 基因失活的重组菌.  1  材料与方法 (ⅰ) 材料.  Klebsiella oxytoca HP1[6], 大肠杆菌DH5α 及质粒 pMHE6 由厦门大学生命科学学院生物能源中心保存, 载体 pMD18-T 购自大连宝生物有限公司. 限制性内切酶 BssHⅡ, MluⅠ, DraⅠ, BamHⅠ, T4连接酶, Taq DNA聚合酶, dNTPs, DNA Mark购自大连宝生物有限公司. 链霉素购自华美生物公司. 质粒小量提取试剂盒和 DNA回收试剂盒购自上海申能博彩生物公司. 产氢培养基: 葡萄糖, 10 g; Na2HPO4· 12H2O, 14.33 g; KH2PO4, 3.63 g; MgSO4·7H2O, 0.37 g; 加自来水至 1 L. 引物合成由上海英骏生物公司完成. 测序工作由大连宝生物有限公司完成.  (ⅱ) aadA 基因表达盒的 PCR 扩增.  根据质粒         第 52卷 第 1期  2007年 1月  论 文 56   www.scichina.com pMHE6全序列设计引物(上游引物, 5′-TCAACGCGT- GAAGTCCAGCGCCAGA-3′; 下游引物 5′-CTAACG- CGTGCAGATCCGTGCACAG-3′), 并在引物两端添加MluⅠ酶切位点(下画线处). 以质粒 pMHE6为模板进行链霉素抗性基因表达盒的 PCR 扩增. PCR 反应条件: 95℃预变性 5 min; 94℃, 30 s, 58℃, 30 s, 72℃, 80 s, 30个循环; 72℃, 7 min.  (ⅲ) 重组质粒 pMD-Str 的构建及重组子的鉴定.  PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收后, 与pMD18-T载体连接, CaCl2法转化 DH5α感受态细胞, 用含 Str (50 µg/mL)的 LB平板筛选克隆子. 碱变性法提取克隆子的质粒, 经 PCR鉴定和 BamHⅠ酶切验证. 阳性克隆子命名为 pMD-Str.  (ⅳ) K. oxytoca HP1 adhE片段的 PCR扩增.  采用 Primer Premier 5.0软件, 参照 GenBank中的 adhE基因(登录号: U00096)设计引物(上游引物, 5′-ATC- AAGCTTGGCATGGGCATCGTTGA-3′; 下游引物 , 5′-CGAGGATCCGGCAATTTATGCCATA-3′), 并在上、 下游引物上分别添加 HindⅢ和 BamHⅠ酶切位点(下画线). 提取 K. oxytoca HP1 的总 DNA 为模板进行adhE基因片段的 PCR扩增. PCR反应条件: 95℃预变性 5 min; 94℃, 30 s, 55℃, 30 s, 72℃, 60 s, 30个循环; 72℃, 7 min.  (ⅴ ) 重组质粒 pTA 的构建及重组子的鉴定 .  PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收后, 与pMD18-T载体连接, CaCl2法转化 DH5α感受态细胞, 用含 Amp (100 µg/mL)的 LB平板筛选克隆子. 碱变性法提取克隆子的质粒, 经 PCR鉴定和测序验证. 将阳性克隆子命名为 pTA.  (ⅵ) 同源整合质粒 pTA-Str 的构建及重组子的鉴定.  经验证无误的 pMD-Str用 MluⅠ酶切, pTA用BssHⅡ酶切 , 用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收pMD-Str 1.8 kb片段和 pTA 3.9 kb片段, 其中 pTA 3.9 kb片段用 SAP去磷酸化处理后, 两片段在 T4连接酶作用下 16℃过夜反应 . 连接产物用 CaCl2 法转化DH5α感受态细胞, 用含 Amp (100 µg/mL)和 Str (50 µg/mL)的 LB平板筛选转化子. 碱变性法提取转化子质粒, 用 SacⅡ, DraⅠ酶切和 PCR鉴定, 结果通过测序进一步证实. 阳性重组子命名为 pTA-Str.  (ⅶ ) 重组菌的转化筛选和 PCR 鉴定 .  分别  以 5′-CGAGGATCCCCACTAACCCGACTTCA-3′和 5′-  CGAGGATCCGGCAATTTATGCCATA-3′ (下画线为BamHⅠ酶切位点)为上下游引物, 以 pTA-Str 为模板扩增得长度约 3.0 kb 的 DNA 片段 5′-adhE-aadA- adhE-3′. 参照文献[7]的方法, 将得到的 DNA 片段纯化后转化K. oxytoca HP1感受态细胞, 并涂布于含 Str (50 µg/mL)的 LB平板, 筛选同源双交换的抗性菌株. 取 adhE (+174 ~ +191, adhE基因起始编码框为+1)为上游引物 5′-ATCAAGCTTGGCATGGGCATC- GTTGA-3′, 依据外源 aadA表达盒序列−540 ~ +1240序列(aadA 基因起始编码框为+1)设计下游引物 5′- ACCAAGGTAGTCGGCAAAT-3′, 以转化菌总 DNA为模板扩增得 1.3 kb产物, 回收片段并测序鉴定.  2  结果 2.1  PCR扩增链霉素抗性基因表达盒 以 pMHE6 为模板, 通过 PCR 扩增得到的产物, 经 1%琼脂糖凝胶电泳, 在 1.8 kb处有一条特异性扩增条带, 与实验预计相符(图 1).    图 1  链霉素抗性基因表达盒 PCR扩增结果 M, D2000L DNA分子量标准; 1, 链霉素抗性基因表达盒 PCR产物  2.2  重组质粒 pTA的构建及重组子的鉴定 将 adhE的 PCR扩增产物与 pMD18-T载体连接, 转化, 挑取 6个白色菌落, 提取质粒后以M13引物进行 PCR扩增, PCR产物为 1.2 kb左右的特异条带(图2), 符合实验预计.   图 2  重组质粒 pTA的 PCR鉴定 M, 1 kb DNA分子量标准; 1~6, 随机挑选的 6个转化子 PCR产物        论 文  第 52卷 第 1期  2007年 1月   www.scichina.com  57 2.3  同源整合质粒 pTA-Str的构建及重组子的鉴定 将 pMD-Str 经 MluⅠ酶切和 pTA 经 BssHⅡ酶   切的产物连接转化 , 用含 Amp (100 µg/mL)和 Str   (50 µg/mL)的 LB 平板筛选得到转化子提取质粒, 经SacⅡ和 DraⅠ酶切鉴定, 琼脂糖凝胶电泳显示的条带大小与理论设计相符, 证实为阳性克隆(图 3 和 4). 测序结果进一步确定引入的外源 aadA序列已定点插入 pTA中.   图 3  质粒 pTA-Str的基本结构   图 4  质粒 pTA-Str 的酶切验证 M, 1 kb DNA分子量标准; 1, pTA-Str/Sac Ⅱ及 DraⅠ双酶切; 2, pTA-Str/SacⅡ单酶切  2.4  K. oxytoca HP1对链霉素抗性的测定 参照文献 [7]进行 . 将对数生长期后期的菌液(A600 = 0.6)经无菌水稀释后, 取 100 µL涂布于链霉素含量不同的 LB 系列平板上, 以不含链霉素的平板作对照 , 观察各处理样品菌落的生长情况 . 结果表明 , 在链霉素浓度为15和 30 µg/mL的平板上出现几个小的单菌落, 而链霉素浓度为 45, 60和 75 µg/mL的平板上无菌落生长 . 依此确定转化菌的链霉素筛选浓度为 50 µg/mL.  2.5  重组菌的 PCR鉴定 以转化子总DNA为模板, 经 PCR得到扩增产物, 1%琼脂糖凝胶电泳显示在 1.3 kb 处有一条特异性扩增条带, 与实验预计相符(图 5). PCR产物经测序鉴定为实验预计的目的片段: K. oxytoca HP1 adhE 基因+174 ~ +868区域片段(adhE起始编码框为+1)和外源aadA表达盒−540 ~ +21序列(aadA基因起始编码框为+1). 依此确定引入的 aadA外源序列已成功地定点插入受体菌细胞染色体基因组中.    图 5  突变株的 PCR鉴定 M, 1 kb DNA Mark; 0, 阴性对照; 1~5, 随机挑选的 5个转化子 PCR产物  2.6  野生菌和重组菌的产氢、产乙醇特性比较 将 K. oxytoca HP1 野生菌和重组菌分别接种于LB 培养基中, 37℃培养 12 h 至对数期后期, 低速离心(4000×g)收集菌体细胞, 然后重新悬浮于放氢培养基. 放氢培养采用 140 mL血清瓶, 装液量 20 mL, 用反口橡胶塞封口后抽真空充高纯氩气以保证无氧状态. 每个实验设 3次重复. 血清瓶置于摇床振荡培养, 培养温度 37℃, 摇床转速 120 r/min. 每隔 12 h取样分析 H2和乙醇. H2用 102G气相层析仪(5A分子筛柱, 上海分析仪器厂)测量; 乙醇用 GC950 气相层析仪(DB-5 毛细管柱, 上海海欣色谱仪器有限公司)测量, 测量结果如图 6 所示. 结果表明, 重组菌的产氢量比野生株提高了 16.07%, 而乙醇浓度下降了 77.47%.    图 6  重组菌、野生菌的产氢、产乙醇比较          第 52卷 第 1期  2007年 1月  论 文 58   www.scichina.com 3  讨论 K. oxytoca HP1兼性厌氧, 能利用葡萄糖、淀粉、木质素、纤维二糖等多种碳源放氢, 并且在气相含氧量高达 10%条件下仍然能放氢. K. oxytoca HP1培养条件简单, 不需要有机氮源, 是一株有较高开发价值的高效放氢菌. 代谢产物分析表明, K. oxytoca HP1呈混合酸发酵特性, 在底物限制的条件下, 乙醇是产氢发酵的主要副产物. Ohta等人[8]用同源重组技术阻断大肠杆菌 K12 菌株的琥珀酸途径, 得到了高产乙醇的重组菌 KO11. Koji等人[9]构建了 LDH失活的 E. coli 突变株, 其产氢能力提高了 17%. 张延平等人[10]敲除了 K. pneumoniae M5aL 的醛脱氢酶基因, 重组菌的 1,3-丙二醇合成浓度提高了 27%~42%.  本研究应用类似的基因操作策略改造本课题组筛选得到的产氢菌株 K. oxytoca HP1的产氢能力. 构建的同源重组质粒 pTA-Str含有 K. oxytoca HP1 adhE基因+174 ~ +1360 区的同源整合片段, 并在+694 ~ +695 处引入 aadA 基因表达盒. 以质粒 pTA-Str 为模板 PCR扩增得长度约 3.1 kb的 5′-adhE-aadA- adhE-3′ DNA片段, 该片段通过转化导入宿主细胞 K. oxytoca HP1 后, 能介导外源的 aadA 基因定点插入宿主细胞基因组的 adhE 基因中, 造成 adhE 基因的插入失活. 同时由于 aadA基因的引入表达使转化菌具有链霉素抗性, 因此可以作为突变株的筛选标记. 厌氧摇瓶发酵结果表明, adhE 缺失菌株的产氢量比野生菌株提高了 16.07%, 而乙醇浓度下降了 70.47%. 这说明通过同源重组技术乙醇途径已经基本被阻断 , 原用于产乙醇的还原力 ,  部分已经被氢酶获得用来产氢 , 从而提高了总产氢量.  参    考    文    献 1 Gross R, Leach M, Bauen A. Progress in renewable energy. Envi-ron Int, 2003, 29: 105—122 2 Das D, Veziroglub T N. Hydrogen production by biological proc-esses: A survey of literature. Int J Hydrogen Energ, 2001, 26: 13—28 3 Tolan J S, Finn R K. Fermentation of D-xylose to ethanol by ge-netically modified Klebsiella planticola. Appl Environ Microb, 1987, 53: 2039—2044 4 Tsai P S, Rao G, Bailey J E. Improvement of Escherichia coli mi-croaerobic metabolism by vitreoscilla hemoglobin: New insights from NAD(P)H fluorescence and culture redox potential. Biotech-nol Bioeng, 1995, 47: 347—354 5 蒋宇, 邵蔚蓝. 嗜热厌氧产乙醇杆菌乙醇代谢途径的初步研究. 南京师范大学学报(自然科学版), 2005, 28: 69—73 6 Long M N, Huang J L, Wu X B, et al. Isolation and characteriza-tion of a high H2-producing strain Klebsiella oxytoca HP1 from a hot spring. Res Microbiol, 2005, 156: 76—81 7 Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T, 等著. 金冬雁, 等译. 分子克隆实验指南(第 2版). 北京: 科学出版社, 1992 8 Ohta K, Beall D S, Mejia, J P, et al. Genetic improvement of Es-cherichia coli for ethanol production: chromosomal integration of Zymomonas mobilis genes encoding pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase Ⅱ. Appl Environ Microb, 1991, 57: 893—900 9 Koji S, Mika W, Hiroshi M, et al. Construction and characteriza-tion of fermentative lactate dehydrogenase Escherichia coli mutant and its potential for bacterial hydrogen production. Appl Biochem Biotech, 1999, 77~79: 317—323 10 张延平, 刘铭, 曹竹安. 醛脱氢酶基因敲除的 K. pneumoniae 重组菌的构建. 中国生物工程杂志, 2005, 25: 34—38  

Klebsiella oxytoca HP1 adhE基因插入失活法构建产氢重组菌

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