国家自然科学基金重点项目(20235020

Frank S.C.Lee

崔淑芬

林焕冰

王小如

Xiamen University Institutional Repository

表1　热炎宁胶囊、半枝莲药材中野黄芩苷的测定结果( n= 5)Table 1　Scutellarin in Reyanning Capsulaand S. baraata ( n= 5)热炎宁胶囊批　号野黄芩苷/( mg·粒- 1)RSD/%半枝莲批　号野黄芩苷/( mg·g- 1)RSD/%040907 1. 88 0. 2 01 8. 33 0. 2050302 1. 90 0. 3 02 8. 43 0. 4050401 1. 91 0. 4 03 8. 35 0. 8乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇、50%乙醇、30%甲醇、30%乙醇和水)进行了考察。由于野黄芩苷在甲醇中的溶解性较好,结果制剂与药材中均以70%甲醇回流30 m in 提取最完全。3. 2　检测波长的选择:选择了野黄芩苷对照品的最大紫外吸收波长335 nm,检测灵敏度高、专属性强。3. 3　流动相系统的选择: 分别用甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸、甲醇-水-冰醋酸-四氢呋喃、乙腈-水、乙腈-水-冰醋酸以不同比例进行考察,结果表明乙腈-水-冰醋酸这一流动相系统色谱峰峰形好, 柱效高,可达到理想的分离度。References:[ 1]　S tate S tandar d of Drug (国家药品标准) [ S] . 2002.[ 2]　Xiao H T , Li X. Adven ces in studies on ch emical con s-t ituents and pharmacological act it ivt ies of S cutellaria bar aata[ J ] . R es I nf T rad it Ch in Med (中药研究与信息) , 2005, 7( 4) : 20-22.[ 3]　J iang X L, Gu Z L. Chemical const ituents and phar macologi-cal act it ivt ies of S cutellaria baraata [ J] . Chin Wild Plant R e-sour (中国野生植物资源) , 2004, 23( 1) : 3-5.[ 4]　Zou J L, Wu Q N. Ad vences in s tudies on ch emical con s-t ituents and pharmacological act it ivt ies of S cutellaria bar aata[ J ] . L i shi z hen Med Mater M ed Re s (时珍国医国药 ) , 2005,16( 2) : 149-151.微乳薄层色谱法鉴别甘草的研究崔淑芬1, 2, 林焕冰3 , F rank S. C. Lee4, 王小如2, 4X( 1. 深圳职业技术学院 应用生物技术系,广东 深圳　518055; 2. 厦门大学化学化工学院 现代分析科学教育部重点实验室,福建 厦门　361005; 3. 南方医科大学 药理学教研室, 广东 广州　510515; 4. 国家海洋局第一海洋研究所青岛现代分析技术及中药标准化重点实验室, 山东 青岛　266061)　　甘草为重要的常用中药,素有“国老”之称, 具止咳化痰、解毒清热、缓急止痛及调和诸药等作用,俗称“十方九草”, 在临床上有大量的应用。《中国药典》2005年版收录的甘草药材有 3种:乌拉尔甘草Gly cy rrhiz a uralensis Fisch.、胀果甘草 G . inf lataBat . 和光果甘草G. glabra L. 不同种类的甘草成分有一定的区别[ 1] ,而采用现有的药典方法并不能区分不同种类的甘草[ 2]。微乳薄层色谱是近几年发展的薄层色谱新方法[ 3～5],处于方法的初创阶段。笔者所在的课题组对微乳薄层色谱进行了系统的理论和应用研究, 本实验研究微乳薄层色谱应用于 3种甘草药材的鉴别。1　仪器与材料　　GAMAG Linomat 5 半自动点样仪, CAMAGReproStar 3 薄层色谱数码成像系统; 聚酰胺薄膜(浙江台州四青生化材料厂) ; Grant XB14超声波清洗机; 滤 膜 ( 美国 M illipor Corporat ion, 孔径0. 45 Lm)。　　表面活性剂十二烷基硫酸钠( SDS)为分析纯(Bio. Basic. Inc. )。正丁醇、甲酸、正庚烷和甲醇皆为分析纯,国产试剂。水为超纯水。对照品甘草苷(质量分数为96. 4%)由厦门大学傅博强博士制备,甘草查耳酮甲(质量分数为99. 1% )由厦门大学王巧娥博士制备。　　甘草药材由中国亿利资源集团公司提供,由中国医学科学院药用植物研究所林寿全教授鉴定品种。2　方法与结果2. 1　供试品溶液的制备:将甘草生药适当粉碎后过60目筛。精密称取甘草药材粉末0. 4 g ,加入50%甲醇溶液 40 mL,冷浸10 h后超声提取30 m in, 离心。上清液挥干,加2 mL 甲醇定容, 过0. 45 Lm滤膜, 滤液作为供试品溶液和2. 0 mg/ mL 的甘草苷对照品溶液和2. 0 mg / mL 的甘草苷对照品溶液。2. 2　对照品溶液的配制:以甲醇为溶剂, 配制2. 0mg/ mL 的甘草查耳酮甲对照品溶液。2. 3　微乳展开剂的配制:笔者对甘草的微乳展开剂·540· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第38卷第 4期 2007 年4 月X 收稿日期: 2006-08-08基金项目:国家自然科学基金重点项目( 20235020)作者简介:崔淑芬( 1969—) ,女,辽宁抚顺人,副教授,博士,主要从事中草药及海洋药物研究。T el: ( 0755) 26731146　E-m ail : s hufencui@ 163. com进行了优化(具体过程和方法另文发表) , 最佳微乳组成: 0. 23 mol/ L SDS+ 16%正丁醇+ 11% 甲醇+2. 4%正庚烷。按照上面的微乳配方把一定量的SDS溶解于适量水中, 然后加入正庚烷、正丁醇和甲酸等,搅拌混匀, 定容, 超声 30 m in 即得澄清透明的微乳液。该微乳展开剂在室温下可稳定4个月以上。2. 4　薄层色谱试验条件: 每个药材供试品溶液(或对照品溶液)用 CAMAG Linomat 5半自动点样仪带状点样 1. 5 LL 于聚酰胺薄膜上, 点样后即展开,上行方式展开,展距为95 mm。待溶剂前沿到达指定位置后, 取出薄层板,晾干。进行366 nm 荧光数码摄像, Wincats 软件自动进行数据处理。2. 5　不同种类甘草的微乳薄层色谱荧光图像: 3个不同种类甘草(乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草)用微乳做流动相的荧光图像(见图1)。可以看出, 微乳色谱结果斑点清晰、集中、不扩散、不拖尾, 荧光明亮。乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草样品中都有绿色的甘草苷荧光斑点, 可以作为鉴别甘草的基本特征,而甘草不同种类的微乳薄层色谱荧光图像区别亦很明显。化学成分研究结果表明唯有胀果甘草中含有甘草查耳酮甲[ 1], 这和微乳薄层色谱图像的结果一致。　1-光果甘草2-胀果甘草3-乌拉尔甘草4-甘草苷5-甘草查耳酮甲1-G . g labra2-G . inf lata3-G . ur alensis4-l iquirit in5-l icoch alcone A图1　甘草的微乳薄层色谱荧光图像Fig. 1　Microemulsion TLC fluorescent imageof Radix Glycy rrhizae2. 6　不同产地胀果甘草和乌拉尔甘草的鉴别: 甘草在全球有29种6变种。其中我国产17～18种3变种。乌拉尔甘草是中药甘草的主要品种, 主产于内蒙古、甘肃、新疆等地。胀果甘草与光果甘草主产于新疆和甘肃。在进行样品收集时,发现市场上流通的光果甘草很少,只在新疆库尔勒市收集到光果甘草, 这说明,在中国,乌拉尔甘草和胀果甘草这两个品种是主流品种。笔者采用微乳薄层色谱法对不同产地的胀果甘草和乌拉尔甘草进行了鉴别。见表1和图2。　　从图 2可以看出,不同产地的胀果甘草都表现出相似的特征,即在Rf为0. 3左右都有显绿色荧光表1　甘草样品来源Table 1　Sources of Radix Glycyrrhizae样品编号 种　类 种植方式 采收时间 产　地1 乌拉尔甘草 野生 2001. 8 新疆和静哈密　　2 乌拉尔甘草 野生 2002. 9 内蒙额济纳旗　　3 乌拉尔甘草 野生 2002. 9 内蒙亿利巴音乌素4 乌拉尔甘草 野生 2002. 10 内蒙亿利上海庙　5 乌拉尔甘草 野生 2002. 11 甘肃兰州　　　　6 乌拉尔甘草 野生 2002. 9 青海贵德　　　　7 乌拉尔甘草 中国药品生物制品检定所对照药材8 胀果甘草　 野生 2002. 5 新疆干固　　　　9 胀果甘草　 野生 2002. 5 新疆和硕　　　　10 胀果甘草　 人工 - 新疆南疆　　　　11 胀果甘草　 野生 2003. 7 新疆库尔勒　　　12 胀果甘草　 中国药品生物制品检定所对照药材各轨道样品1～12顺序同表 1样品编号, 13轨道为甘草查耳酮甲Sequ ence ( 1—12) of s am ple on t rack is s am e to sample n umberin T able 1, t rack 13 is marker licochalcone A图 2　不同产地甘草的 366 nm荧光图像Fig. 2　Identification of dif ferent species of RadixGlycy rrhizae from various habitats usingmicroemulsion TLC f ingerprint imageunder UV light 366 nm的甘草查耳酮甲; 而不同产地的乌拉尔甘草亦表现出相同的特征,即在Rf 值为0. 28和0. 48有两个强烈的蓝色荧光斑点。这些特征可以区别这两种甘草。另外,不同产地的胀果甘草中甘草查尔酮甲斑点强弱不等,表明不同产地样品的差异。乌拉尔甘草除在Rf值为 0. 28和 0. 48有两个共同的蓝色荧光斑点外,不同产地的荧光图像有所不同,内蒙产乌拉尔甘草有更多的荧光斑点,是否可根据这个特征鉴别不同产地的乌拉尔甘草,还需要进一步扩大试验样本及做这些斑点的化学成分鉴别。3　讨论　　在正相微乳薄层色谱中, 展开剂为极性很大的微乳水溶液。随着展开距离的增大,会出现两个“溶剂前沿”: 第一溶剂前沿是水、盐等组成的溶剂前沿,第二溶剂前沿是含表面活性剂微乳的前沿。这样, 样品中的糖类、氨基酸等亲水性物质多数迁移较快, 多集中在第一溶剂前沿和第二溶剂前沿之间,而中药有效成分多在原点和第二溶剂前沿之间进行分离。在甘草的微乳薄层色谱中, 供试液的制备只需用甲·541·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第38卷第 4期 2007 年4 月醇溶液提取, 省却了传统薄层色谱法中的不同极性溶剂提取分离、多次萃取等繁琐“清洗”步骤,而所得薄层图像明亮清晰,各成分分离很好。因此可大胆推测,由于微乳溶液的组成特点,决定了微乳薄层色谱可省略多数供试液的前处理“清洗”步骤, 大大节省实验时间和提高结果的重现性。　　薄层色谱有别于其他色谱技术,除了都有固定相和流动相外,还存在气相。气相会对分离结果产生显著影响。常规薄层色谱多采用几种有机溶剂组成的混合溶剂, 各种有机溶剂的挥发性不同, 使得展开过程更加复杂。在甘草微乳薄层展开过程中,进行了单槽和双槽展开缸、未饱和与饱和30～80 min 的比较实验。实验结果表明,展开室的形状和饱和情况对甘草各成分的分离几乎没有影响。关于甘草微乳薄层色谱展开特点的原因探究, 笔者认为可能是因为微乳作为展开剂时,主要成分为水,表面活性剂形成的微乳挥发性不大, 微乳展开剂长期放置亦可保持成分稳定。而展开过程亦因为展开剂成分的稳定,所以展开室的形状和饱和情况对分离效果没有什么影响。另外,也考察了温度和湿度对展开效果的影响。实验结果表明, 30%～90%相对湿度的分离效果几乎没有差异。这一特点和微乳展开剂大量水分组成相联系,亦可以很容易得到解释。温度考察在15～30℃进行,设置了4个温度水平: 15、20、25、30℃, 结果显示温度对甘草微乳薄层影响不大。　　微乳薄层色谱具有明显的荧光增强增稳效应[ 6] , 而色彩鲜明的荧光信息对薄层色谱具有特别突出的意义。在甘草的微乳薄层鉴别中,由于微乳的荧光增强效应, 无需衍生即可根据丰富的荧光信息进行鉴别。而甘草的传统薄层色谱则需要硫酸乙醇喷雾、加热等步骤才能得到荧光图像。　　综上所述, 微乳薄层色谱由于在供试品制备、展开、衍生等步骤所表现出来的优于传统薄层色谱的优点,使其重现性大大提高。微乳薄层色谱用于不同种类的甘草鉴别, 方法简单经济, 图像形象直观, 无需衍生即可区分《中国药典》收录的3种甘草药材。　　本研究样品收集得到厦门大学一开元区高新技术研究开发基地王文慎经理的帮助,以此表示感谢。References:[1]　Hu J F, Shen F J. 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微乳薄层色谱法鉴别甘草的研究

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/142735/%e5%be%ae%e4%b9%b3%e8%96%84%e5%b1%82%e8%89%b2%e8%b0%b1%e6%b3%95%e9%89%b4%e5%88%ab%e7%94%98%e8%8d%89%e7%9a%84%e7%a0%94%e7%a9%b6.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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