池信才

王军

王德祥

苏永全

鄢庆枇

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17EXPERIMENT & TECHNOLOGY实验与技术网箱养殖青石斑鱼河流弧菌病研究STUDIES ONVIBRIOSIS( Vibrio fluvialis) IN CULTURED Epinephelusawoara鄢庆枇1 ,2 苏永全 1 王 军 1 池信才 1 王德祥 1( 1厦门大学海洋学系, 厦门大学亚热带海洋研究所 361005)( 2集美大学水产养殖系 厦门 361021)关键词 青石斑鱼, 弧菌病, 河流弧菌 Ñ随着养殖规模的扩大, 病害问题日益严重, 严重地制约着石斑鱼养殖业健康发展。刘秀珍等 1994年报道创伤弧菌是石斑鱼的病害弧菌病的病原。本文作者对 1999年夏季厦门市同安区琼头村网箱养殖石斑鱼的严重病害进行了研究, 试图能为养殖青石斑鱼( Epinephelus awoara)的病害防治提供理论依据。1 材料与方法1. 1 试验用鱼患病石斑鱼取自同安区琼头村养殖网箱 (体重97~ 245 g) ; 健康石斑鱼购自厦门火烧屿养殖网箱(体重 81~ 114 g) ,暂养备用。1. 2 病原菌的分离将病鱼体表清洗消毒后, 用无菌操作方法从肝脏、肾脏部位及血液取材 , 在营养琼脂平板和 TCBS琼脂平板上划线分离, 30 e 培养 24 h, 挑取优势菌落分别在营养琼脂和 TCBS琼脂平板上划线分离培养数次, 获得纯培养物后接种到营养琼脂斜面备用。1. 3 人工感染试验1. 3. 1 菌悬液 A 550值标准曲线绘制将已纯化的菌株接种到营养琼脂斜面, 30 e 培养 24 h, 用无菌生理盐水洗脱菌苔, 制成菌悬液, 再用无菌生理盐水稀释成不同浓度。以无菌生理盐水为对照 , 测定各浓度菌悬液在 550 nm波长处的吸收值A 550。同时用平板计数法测定菌悬液的浓度,以 A 550值为纵坐标, 菌浓度为横坐标, 绘制标准曲线。1. 3. 2 菌悬液人工感染试验1. 3. 2. 1 注射感染 供试菌株经培养后, 制成菌悬液, 光谱法测定菌浓度, 稀释成 9 @ 10 8和 9 @ 10 7cfu/ ml, 对试验鱼(已暂养 7 d) 进行肌肉注射, 每尾注射 0. 2 ml, 对照组每尾注射无菌生理盐水 0. 2 ml。通气喂养, 连续观察 15 d。1. 3. 2. 2 浸泡感染 将制备好的菌悬液倒入饲养石斑鱼的水族箱中, 使海水中的菌浓度达到 105cfu/ ml,通气喂养 15 d,每天换水后加入一定量的菌悬液,使海水中的菌浓度维持在 10 5 cfu/ ml。1. 3. 3 感染菌株的分离从人工感染患病死亡的石斑鱼内脏部位和血液中,同上法分离致病菌, 与人工感染试验所用菌株进行比较。1. 4 病原菌的鉴定病原菌的形态及生理生化特征的检测和鉴定按文献[ 5]、SWF生化板及相关文献[ 4 ]等方法鉴定。1. 5 药敏试验将菌悬液均匀涂布于营养琼脂平板上, 然后贴上不同药物的药敏纸片 (购自上海市卫生防疫站) , 30e 恒温培养 18 h后检测抑菌效果。2 结果与讨论2. 1 病症1999年 5月中旬至 6月, 在厦门地区持续高温天气下, 同安网箱养殖石斑鱼开始出现死亡, 从起初的每个网箱每天死亡 1~ 2尾,增加到二三十尾。现场检测发现: 病鱼活动能力下降, 摄食减少甚至不摄食,有的体色变黑。解剖发现病鱼肝脏呈土黄色, 略有肿大,胃肠内容物很少。收稿日期: 2000-08-11;修回日期: 2001-03-05Marine Sciences /Vol. 25, No. 10/ 2001海洋科学/ 2001年 /第 25卷 /第 10期18图 1 病原菌的电镜照片( @ 20 000)2. 2 病原菌的分离和回归感染从病鱼的肝、肾和血液中分离出大量细菌,这些细菌在营养琼脂和 TCBS琼脂上形成的菌落一致, 从中挑选 2株细菌,编号为 TS-1和 TS-2。用肌肉注射和菌液浸泡两种人工感染方法都能使石斑鱼发病, 感染病鱼的症状表现与养殖网箱病鱼基本一致, 都表现为体色变深、活动能力减弱、进食减少甚至不进食。解剖发现病鱼肝肿大,呈土黄色,从内脏中分离培养出大量细菌。人工感染的结果见表 1。2. 3 菌株再分离与鉴定从人工感染患病即将死亡的石斑鱼的内脏和血液中分离出大量细菌, 这些细菌的菌落特征与人工感染所用菌株的菌落特征一致。2. 3. 1 菌体的形态特征电镜下观察到菌株 TS-1和 TS-2的菌体细胞呈短杆状或略有弯曲, 在菌体的一端有单根鞭毛 (图 1)。菌体细胞的大小为 ( 0. 5~ 0. 9) Lm @ ( 1. 5~ 2. 3)Lm。两株细菌皆无荚膜, 无鞭毛,细胞分散排列。2. 3. 2 菌株的生理生化特性对菌株 TS-1和 TS-2进行了 42项生理生化特性的测定, 结果见表 2。从表 2可以看出, 菌株 TS-1和 TS-2的各项生化特性非常相似(超过95% )。以上各项试验结果与5伯杰氏细菌鉴定手册6 (第 9版) 对河流弧菌 Ñ的描述基本一致, 而与其他弧菌有较大区别, 因此确定这两株病原菌为河流弧菌 Ñ。2. 4 药敏试验应用药敏纸片法测定了病原菌对 50种抗菌药物的敏感性,结果见表 3。表 2  2株病原菌的生理生化特性菌株 T S- 1 T S-2 河流弧菌Ñ革兰氏染色 G- G- G-游动现象 - - -O/ 129敏感( 10 Lg) - - -O/ 129敏感( 150 Lg) + + +T CBS上形成菌落 黄 黄 黄4 e 生长 - - d30 e 生长 + + +40 e 生长 - - -0% NaCl生长 - - d3% NaCl生长 + + +6% NaCl生长 + + +8% NaCl生长 - ( + ) d10% NaCl生长 - - -氧化酶 + + +赖氨酸脱羧酶 - - -鸟氨酸脱羧酶 - - -精氨酸双水解酶 + + +H2S - - -IND - - -VP - - -TDA - - -柠檬酸盐利用 + + +甘露醇 + + +纤维二糖 - - dONPG + + +硝酸盐还原 + + +尿素 - - -D-葡萄糖产气 - - -LAC - - -SUC + + +酶的产生淀粉酶 + + +明胶酶 + + +脂酶 + + +藻酸酶 - - -几丁质酶 + + +糖类利用木糖 - - -阿拉伯糖 + + +半乳糖 + + +蜜二糖 - - -甘露糖 + + +海藻糖 + + +水杨苷 + + +注: / - 0表示阴性; / + 0表示阳性; / ( + ) 0表示弱阳性; / d0表示可变化, 即有的菌株为阳性,有的为阴性。表 1  青石斑鱼人工感染试验结果试验 菌株 感染方式 菌浓度 剂量 试验数 死亡数组别 ( cfu/ ml) ( ml) (尾) (尾)1 T S- 1 肌肉注射 1. 0 @ 109 0. 2 5 52 T S- 1 肌肉注射 1. 0 @ 108 0. 2 5 33 T S- 2 肌肉注射 1. 0 @ 109 0. 2 5 54 T S- 2 肌肉注射 1. 0 @ 108 0. 2 5 25 T S- 1 菌液浸泡 1. 0 @ 105 - 5 36 T S- 2 菌液浸泡 1. 0 @ 105 - 5 37 对照组 肌肉注射 生理盐水 0. 2 5 08 对照组 浸泡 自然海水 - 5 0/ - 0 代表采取浸泡感染, 没有注射剂量。EXPERIMENT & TECHNOLOGY实验与技术Marine Sciences /Vol . 25, No. 10/ 2001 19由表 3可知, 病原菌对丁胺卡那霉素、氯霉素、氟哌酸等 11种药物敏感, 而麦迪霉素、乙酰螺旋霉素、青霉素 G等 5种药物对病原菌没有抑制作用。对于5渔药手册6 [ 3 ]中的药物, 两株病原菌只对氯霉素和磺胺甲基异恶唑两种药物敏感, 青霉素和氨苄青霉素对病原菌没有作用, 其他的渔用药物, 如四环素、红霉素、链霉素、庆大霉素、吡哌酸、痢特灵等, 病原菌均有一定的耐药性。两株病原菌的药敏结果基本相同, 这也间接说明两株病原菌属于同一种菌。弧菌是海水环境中的正常菌群, 广泛分布在自然海区中, 一般情况下不会引起养殖动物发生病害。但在养殖海域环境条件恶化引起这些条件致病菌大量繁殖, 而养殖动物抗病力低下的情况下就会暴发弧菌病。Beatty K. T. 等 1990年与West P. A.等 1983年的研究结果表明病原菌的致病性取决于海水中细菌数量、养殖动物的免疫力及海水理化物质等环境条件的影响。现场调研得知: 由于长期大量使用抗生素, 会导致水体正常微生物菌群失调,也使养殖环境中的许多细菌对常用抗生素产生了抗药性, 给疾病的治疗带来很大的困难。同时, 长期使用抗生素给养殖动物内脏机能造成损伤, 导致机体免疫力下降, 这些都增加了细菌病暴发的可能性 [ 1 ]。因此, 国内外学者一致认为对海洋生物的弧菌病应以预防为主 [ 2 ], 具体措施如: 合理控制养殖密度、改善水质环境, 维持一定量的藻类和有益微生物, 保持养殖环境生态平衡、合理使用抗生素等。参考文献1 潘连德、陈 辉。水产科技情报, 1998, 25( 4) : 169~ 1732 肖 慧、李 军、王祥红等。青岛海洋大学学报, 1999,29( 1) : 87~ 933 农业部5渔药手册6编撰委员会。渔药手册。北京:中国科学技术出版社, 1998。156~ 1934 麦克法丁 J. E. 编,林万明译。医学细菌生化试验鉴定手册。北京:人民卫生出版社, 1985。305~ 3095 Holt J. G. . Bergeycs Manual of Determinat iveBacteriology . 9th ed. Baltimore: Williams & Wilkins.1994. 518~ 538(本文编辑: 刘珊珊)表 3  病原菌对抗菌药物的敏感性菌株 TS-1 TS-2四环素* M M氯霉素* S S红霉素* R R庆大霉素* M M链霉素* M M吡哌酸* M M痢特灵* M M青霉素 G* - -氨苄青霉素* - -磺胺甲基异恶唑* S S林可霉素 M M丁胺卡那霉素 S S新生霉素 R R麦迪霉素 - -壮观霉素 S M妥布霉素 M M柱晶白霉素 R R新霉素 M M乙酰螺旋霉素 - -克林霉素 R R强力霉素 M S氟嗪酸 S S萘啶酸 M M头孢拉定 R R头孢氨苄 R R头孢克洛 M M头孢孟多 M M头孢呋新 R R头孢三嗪 S S头孢哌酮 S S头孢噻吩 R R头孢噻肟 S S头孢噻甲羧肟 S S头孢唑啉 R R多粘菌素 R R利复平 R R杆菌肽 - -复方新诺明 S S氨曲南 M M奥格门丁 R R环丙沙星 M M苯唑青霉素 R R羧苄青霉素 R R氧哌嗪青霉素 M M呋喃妥因 S SO/ 129( 10 Lg) R RO/ 129( 150 Lg) S S优力欣 R R注:/ S0表示敏感;/ M0表示中等敏感; / R0表示不敏感; / - 0表示没有抑制作用; / * 0为5渔药手册6中的药物。EXPERIMENT & TECHNOLOGY实验与技术

网箱养殖青石斑鱼河流弧菌病研究

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网箱养殖青石斑鱼河流弧菌病研究

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