灭活病毒诱导牙鲆传代细胞差减cDNA文库的构建及分析

Abstract

以灭活大鳞鲆弹状病毒诱导的牙鲆(Paralichthys olivaceus)传代细胞作为检测子(tester)，正常对照细胞作为驱赶子(driver)，分别提取mRNA，逆转录合成双链cDNA。经两轮差减杂交，两轮抑制性PCR扩增后，取正向差减的PCR产物与T载体连接，构建抑制差减cDNA文库，随机挑取7400余个克隆，对其中4200多个克隆进行PCR扩增鉴定，发现近4000个克隆中均含有插入片段，大小在250～1000bps之间，进一步对含有插入片段的近4000个克隆进行了斑点杂交筛选，得到近668个可能含有抗病毒或与免疫相关的阳性克隆。初步的结果表明所建立的差减cDNA文库适合进一步克隆鱼类抗病毒相关新基因