Development and optimization of a methodology to synthetize chitosan/cetuximab conjugates for encapsulate siRNA and targeting to EGFR overexpressing cells

Abstract

O uso terapêutico de Small Interfering RNA (siRNA) tem sido observado como uma potencial nova abordagem para o tratamento do cancro. O desafio-chave no campo clínico consiste na entrega de siRNA no citosol das células-alvo. Assim, vários sistemas de entrega de siRNA, tais como lipossomas, polímeros e partículas inorgânicas, têm sido desenvolvidos de forma a melhorar a eficácia terapêutica do siRNA. O nosso principal objectivo neste projeto, que deu origem a esta dissertação, foi desenvolver novos protocolos, bem como optimizar outros já existentes, para o uso na produção/síntese de conjugados de quitosano/cetuximab, de forma a utilizar estes últimos para encapsular siRNA e direccioná-los para as células que sobreexpressam EGFR. Diversos desafios foram apresentados ao longo deste processo, assim, várias foram as tentativas de produzir um conjugado viável e em concentração razoável, em diferentes proporções molares de cetuximab para quitosano. Não foram apenas os tempos de reacção uma preocupação, mas também e principalmente as concentrações dos compostos e a adição ou remoção de diferentes passos do processo foram tidos em conta. No final, um novo protocolo foi proposto. Após o desenvolvimento e optimização do novo protocolo de conjugação, a segunda linha de objectivos consistiu na análise de conjugados através de FTIR de forma a confirmar a presença de um verdadeiro novo conjugado no produto final. A quantificação proteica foi, de igual forma, determinada em pré- e pós- filtração dos produtos, uma vez que nos iria dizer, por exclusão, que se os produtos préultrafiltrados possuíssem algum material proteico que pudesse ser, estaria conjugado com o LMWChi, uma vez que se estivesse livre teria passado a membrana de filtração (membrana de 150000 MW) Finalmente, a última linha de trabalhos deste projeto consistiu no teste em células dos conjugados produzidos, recorrendo aos ensaios com MTT e LDH com o objetivo de avaliar os seus efeitos citotóxicos. Um par dos conjugados produzidos com sucesso poderão ser utilizados no futuro para encapsular siRNA, produzir nanopartículas e melhorar a eficácia terapêutica do siRNA como terapia direccionada contra o cancro do pulmão das células não XVII pequenas, ainda assim considerando que muito trabalho haverá a fazer ao nível da eficiência de encapsulação do conjugad