En el laboratorio de calidad de alimentos, suelos y agua se realizó el desarrollo y estandarización de una metodología para la separación, identificación y cuantificación de azúcares como sacarosa, rafinosa y estaquiosa por cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un detector de índice de refracción. Se realizó la puesta a punto de la técnica de extracción y cuantificación de azúcares solubles en agua en harina y poroto de soja.EEA PergaminoFil: Chale, Julieta. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Pergamino. Sección Aves; ArgentinaFil: Moro, María Soledad. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Pergamino. Sección Laboratorio Calidad de Alimento, Suelos y Agua; ArgentinaFil: Farroni, Abel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Pergamino. Sección Laboratorio Calidad de Alimento, Suelos y Agua; Argentin

Chale, Julieta

Farroni, Abel Eduardo

Moro, Maria Soledad

Spanish

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RTA / Vol 10 / N°3976INTRODUCCIONDebido al constante mejoramiento genético en los diferentes cultivos se han producido incremen-tos en los rendimientos por hectárea y cambios en el contenido de nutrientes (Azcona et al., 2007). En relación a las harinas de soja, existen antece-dentes que muestran diferencias en su valor nu-tricional según el país de origen (de Coca-Sinova et al., 2008).Estudios realizados en INTA (Azcona comunica-ción personal) mostraron que al comparar harinas de soja producidas en Argentina se observaron mejoras en la utilización de la energía bruta (EMV/EB) al reducirse el contenido de fibra cruda. En el mismo estudio se analizaron harinas de distin-ta procedencia (USA y Brasil) y se observó que la harina de USA presentó un contenido de fibra (3.69%) intermedio entre la baja fibra Argentina (4.06%) y la Brasilera (3.26%). A su vez, la que mejor EMV/EB presentó fue la harina de USA (69.2%), luego la Argentina (67.6%) y por último la Brasilera (66.8%). Estos resultados podrían estar asociados a diferencias en el contenido de poli-sacáridos de acuerdo con la procedencia de las muestras.Según resultados preliminares obtenidos en INTA (PNPA 1126053 – Proyecto Específico de Nutrición de Monogástricos), en el caso de la soja integral, el contenido total de polisacáridos dismi-nuye como consecuencia de una disminución del contenido de S, R y E. Por su parte, el contenido de polisacáridos de las distintas sojas producidas DESARROLLO DE UNA METODOLOGIA ANALITICA PARA CUANTIFICAR AZUCARES EN POROTO DE SOJAJulieta Chale1*, Maria Soledad Moro2, Abel Farroni2En el laboratorio de calidad de alimentos, suelos y agua se realizó el desarrollo y estandarización de una metodología para la separación, identificación y cuantificación de azúcares como sacarosa (S), rafinosa (R) y estaquiosa (E) por cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un detector de ín-dice de refracción (HPLC-IR). Se realizó la puesta a punto de la técnica de extracción y cuantificación de azúcares solubles en agua en harina y poroto de soja.1-Sección Aves. 2- Laboratorio de Calidad de Alimentos, Suelos y Agua. EEA Pergamino Av. Frondizi (Ruta 32) km 4.5 – (2700) Pergamino – Buenos Aires * chale.julieta@inta.gob.aren un mismo ambiente fue variable siendo los valores extremos 37,2% y 22.9%. Estos resulta-dos indicarían que el contenido de azúcares varía según genotipo y zona (ambiente). Por otro lado, existen estudios que demuestran una correlación negativa entre el contenido de polisacáridos y el aprovechamiento de la energía (Iglesias et al., 2015). Esto resalta la importancia de conocer las distintas fracciones químicas de azúcares y su efecto sobre la digestibilidad de la soja.Existen varios métodos para determinar azúca-res en poroto de soja incluyendo la cromatografía gaseosa, enzimáticos, que presentan el problema de no diferenciar estaquiosa y rafinosa y el méto-do elegido para el presente trabajo, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).En base a estos antecedentes, surge la impor-tancia de determinar la relación entre el contenido de azúcares de distintas variedades de soja y la energía metabolizable del poroto de soja.ObJETIvODesarrollar un método para la separación, identificación y cuantificación de azúcares li-bres como S, R y E presentes en poroto y hari-na de soja por HPLC-IR.MATERIALES y METODOSSe utilizaron dos muestras diferentes, harina de soja (3330 Protoil) y poroto de soja (3312 INTA Oliveros 14-15), desactivadas a escala de labo-ratorio según protocolo establecido (Chale et al., 2017). Además se probaron dos tiempos de ex-Palabras clave: HPLC, Sacarosa, Rafinosa, Estaquiosa, Oligosacáridos.MetodologíaDESARROLLO DE UNA METODOLOGIA ANALITICA PARA CUANTIFICAR AZUCARES EN POROTO DE SOJAAbril 2019, Argentina77tracción 30 y 60 min. El poroto de soja se molió en un molino de impacto refrigerado, se realizaron dos ciclos de 30 s utilizando un tamiz de 0,5 mm. Los lípidos se extrajeron con hexano por la me-todología Twisselman utilizando 5 g de harina o poroto de soja molido.Para realizar la extracción de los azúcares se colocaron 200 mg de muestra en un tubo de cen-trifuga, se agregaron 7,5 ml de acetonitrilo (ACN), grado HPLC (LiChrosolv®, Merck) y 7,5 ml de agua para inyectable (API) provista por el Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas “Dr. Julio I. Maiztegui” filtrada con membrana de nylon 0.22 µm. Se agitó en vortex cada 5 min por 5 s durante 30 y 60 min. Se centrifugó a 5000 rpm por 15 min y se separó el sobrenadante. Se repitió la extracción juntando ambos sobrenadantes. El ex-tracto se filtró por membrana de nylon de 0,22 µm a viales para HPLC.Para calcular la recuperación se prepararon muestras enriquecidas con una cantidad conoci-da de estándar de sacarosa y luego se realizó la extracción como se detalla en el párrafo anterior.Los estándares, las muestras y las muestras enriquecidas se analizaron utilizando un equi-po HPLC 1050 (Hewlett-Packard) acoplado a un detector de Índice de Refracción HP 1047 A. Se separaron a través de una columna con grupos amino (Kromasil KR100-5NH2 250 x 4,6 mm y pre-columna G100-5-NH2 KIT 4,6mm START KIT 100-5NH2) utilizando como fase móvil ACN:H20 (60:40) con un flujo de 1,5 ml/min a 30°C y un volumen de inyección 10 µl. Para el presente ensayo se realizaron las cur-vas de calibración a partir de diluciones de están-dares dentro del rango óptimo de concentración que se encuentra en la bibliografía para los distin-tos azúcares (González, et al., 2009). Los rangos ensayados fueron para Sacarosa 100-2000 mg/l (BioUltra, for molecular biology, > 99.5%, Sigma - Aldrich); Rafinosa 100-600 mg/l (D-(+)-Raffinose pentahydrate – BioXtra, >99% Sigma - Aldrich); y Estaquiosa 100-900 mg/l (Stachyose hydrate, > 98%, Sigma - Aldrich). El porcentaje de azúcares se calculó integrando el área de los picos de los cromatogramas y aplicando la ecuación de la rec-ta obtenida en las curvas de calibración. El resul-tado se expresó en g % en base seca (g de azúcar en 100 g de poroto de soja).RESULTADOSEn la figura 1 se muestra un cromatograma co-rrespondiente a una mezcla de estándares de los tres azúcares estudiados. Los tres estándares presentaron una completa separación con picos simétricos y luego de cada pico el cromatograma retomó la línea de base. Se calculó el factor de resolución (R) el cual es una medida cuantitativa del grado de separación de dos picos. Un valor de 1,5 representa una separación hasta la línea base de ambos picos y un valor de 1,0 repre-senta una resolución del 90%. En algunos casos esto es suficiente para los cálculos del área de los picos (análisis cuantitativo). Valores de Rs < 1 indican solapamiento; valores de Rs ≥ 1 indican separación. El valor obtenido entre los picos de S y R fue de 1,827 y entres R y E fue de 2,225. Si bien el cromatograma presentado llega hasta los 15 minutos cuando se corrieron las muestras se observó que no aparecen picos después de los 10 minutos y se seleccionó este tiempo de corrida. A continuación se muestran las curvas de cali-bración obtenidas con la ecuación de la recta para S (Figura 2), R (Figura 3) y E (Figura 4). Los tiem-pos de retención de los estándares fueron de 4, 5 y 7 min para S, R y E respectivamente.En la tabla 1 se muestran los resultados obte-nidos de las muestras fortificadas con sacarosa comparados con las muestras sin fortificar. A partir de la diferencia entre estos valores se calculó el porcentaje de recuperación para cada una de las extracciones a 30 minutos y 60 minutos.Figura 1. Cromatograma correspondiente a una mezcla de estándares de S, R y E. Sobre cada pico se indica el nombre del azúcar y el tiempo de retención en minutos.MetodologíaJULIETA CHALE1*, MARIA SOLEDAD MORO2, ABEL FARRONI2RTA / Vol 10 / N°3978Figura 2. Curva de calibración sacarosaFigura 3. Curva de calibración rafinosa.Figura 4. Curva de calibración estaquiosa.MetodologíaDESARROLLO DE UNA METODOLOGIA ANALITICA PARA CUANTIFICAR AZUCARES EN POROTO DE SOJAAbril 2019, Argentina79Todas las recuperaciones fueron superiores al 80% que es el valor mínimo aceptable según las normas de la United States Pharmacopeial, 2018. Cuando se extrajo durante 60 minutos no se observó un incremento significativo de la re-cuperación.CONCLUSIONESSe desarrolló la metodología para la cuantifi-cación de azúcares por HPLC estandarizando los parámetros cromatográficos como flujo, fase móvil, temperatura y tiempo de corrida de 10 min. Con los parámetros establecidos se logró una buena separación e identificación con los tiempos de retención de los estándares S, R y E. Se reali-zaron las curvas de calibración para la cuantifica-ción de los azúcares.El tiempo de extracción de azúcares solubles en agua de 30 min presentó una recuperación acep-table de S (>80 %) y permite hacer más eficientes los tiempos de análisis.La metodología establecida puede ser utilizada para la cuantificación de azúcares libres en soja.Tabla 1. Porcentaje de recuperación de sacarosaMuestra Tiempo (min)Agregado de S (mg) en 0,2 g de muestraSacarosa (mg/0,2 g muestra)Recuperación (mg)Recuperación (%)Poroto de soja 30 - 16,610,3 81,7Poroto de soja 30 12,6 26,9Poroto de soja 60 - 15,910,9 87,2Poroto de soja 60 12,5 26,8Harina de soja 30 - 17,810,8 87,8Harina de soja 30 12,3 28,6Harina de soja 60 - 17,511,0 88,0Harina de soja 60 12,5 28,5bIbLIOGRAFIAAzcona, J. O., Iglesias, B. F., Morao, L. R., & Schang, M. J. (2007). Composición de ingredien-tes argentinos: maíz y soja. I Congreso Argentino de Nutrición Animal (pp. 89-96). Parque Norte - Buenos Aires: CAENA.Iglesias, B. F., Azcona, J. O., Schang, M. J., & Charrière, M. V. (2015, 9). Avances en la carac-terización nutricional de maíz y soja. Agroindus-tria(136), 18-30.González, M., Hermida, M., Sueiro, S., Serra-no, M. P., & G.G., M. (2009). Estudio comparativo del contenido en azúcares (sacarosa, estaquiosa y rafinosa) de la harina de soja según proceden-cia. AIDA, XIII Jornadas sobre Producción Animal, Tomo I, 211-213.Chale, J., Iglesias, B. F., Azcona, J. O., Charriè-re, M. V., Cabrera, A. M., & Christeler, B. (2017). Desarrollo de una metodología para el desactiva-do de poroto de soja a escala de laboratorio. Agro-industria, 35(145), 62-65.United States Pharmacopeial USP41 (2018) <1225> Validation of compendial procedure <<DECARGAR ARTíCULOMetodologíaJULIETA CHALE1*, MARIA SOLEDAD MORO2, ABEL FARRONI2

Desarrollo de una metodología analítica para cuantificar azúcares en poroto de soja

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