Desde el INTA aseguran que, mediante esta herramienta biotecnológica, se mejoran los caracteres agronómicos de interés de los alimentos consumidos por los animales, lo que impacta en una mayor sustentabilidad y efi ciencia. Las ventajas de impulsar el diseño genético como estrategia productiva.Gerencia de Comunicación e Imagen Institucional, DG SICC, INTAFil: Pérez Casar, María Laura. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Dirección General de Sistemas de Información, Comunicación y Calidad. Gerencia de Comunicación e Imagen Institucional; Argentin

Perez Casar, María Laura

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151Agosto 2019, ArgentinaEditar el genoma de la alfalfa para aumentar su rendimientoAl analizar el escenario mundial, el aumento de la producción de alimen-tos por superfi cie es escaso, por lo que surge la necesidad de plantear estrate-gias que consideren el incremento del rendimiento por unidad de área. Ese es el camino para poder dar respuesta a la demanda de alimentos que, cada vez, será mayor.En este contexto, los especialistas pon-deran el rol que ocupa la edición génica vegetal al permitir mejorar los forrajes y alimentos consumidos por los animales, lo que impacta en una mayor sustentabi-lidad, previsión y efi ciencia de las produc-ciones. En el INTA impulsan la edición del genoma de la alfalfa para aumentar la ob-tención de biomasa, resistencia a estrés abiótico y el retraso de la fl oración.POR LAURA PÉREZ CASARDesde el INTA aseguran que, mediante esta herramienta biotecnológica, se mejoran loscaracteres agronómicos de interés de los alimentos consumidos por los animales, lo que impacta en una mayor sustentabilidad y efi ciencia. Las ventajas de impulsar el diseño genético como estrategia productiva.Aníbal Pordomingo –coordinador del pro-grama Carnes y Fibras del INTA–, subrayó el gran aporte que hace y hará la edición génica (EG) a la ganadería, tanto en el me-joramiento en animales como en las plan-tas en benefi cio de la producción sustenta-ble y la predictividad de los resultados, en especial, en ambientes extremos.Y aseguró que “el mayor avance en el sector ganadero se va a dar por la edi-ción génica en la producción vegetal, con grandes aportes a la ganadería de la mano de mejores forrajes y alimentos”.Por su parte, Sergio Feingold –coordi-nador nacional del programa nacional de Biotecnología del INTA–, aseguró que “la edición génica representa una revolución tecnológica pocas veces vista, debido no solo a sus particulares ventajas técnicas, sino a la posibilidad de introducir modifi -caciones genéticas con alta efi ciencia e inusitada velocidad”.En esta línea, Gabriela Soto –especialis-ta en ingeniería genética de leguminosas del Instituto de Agrobiotecnología y Biolo-gía Molecular (IABiMo, INTA-CONICET)–, especifi có: “El INTA trabaja en la edición del genoma de alfalfa, en especial en los genes que brindan información o están di-rectamente relacionados con el aumento de la productividad de esta forrajera”.“Con este objetivo, y mediante la téc-nica de edición génica vía CRISPR/Cas, logramos generar cuatro vectores bina-rios para la eliminación de un gen endó-geno determinado (knock out) y para la edición puntual un gen endógeno (base editing) de alfalfa”, explicó Soto.De izq. a der. Las investigadoras Margarita Stritzler, Emilia Bottero y Gabriela Soto.PRODUCTIVIDAD FORRAJERAEditar el genoma de la alfalfa para aumentar su rendimiento152 ACTUALIDAD EN I+D RIA / Vol. 45 / N.º 2Editar el genoma de la alfalfa para aumentar su rendimientoLa edición génicarepresenta una revolución tecnológica pocas veces vista.Con herramientasbiotecnológicas como la edición génica, se potencia el mejoramiento genético convencional.Según especificó la investigadora, este trabajo permitirá potenciar el crecimien-to y desarrollo vegetativo de la alfalfa, como así también obtener un fenotipo de mayor producción de biomasa fácil-mente reconocible. Además, en estos individuos, se estudiará el retraso de la floración, que también es un carácter de-seable en alfalfa.A su vez, se trabajará en la tolerancia a condiciones de estrés abiótico y retraso de senescencia. “Para ello, realizaremos un knock out de un gen previamente ca-racterizado en nuestro grupo mediante mutantes en Arabisposis”, indicó Soto, quien agregó: “Otro punto que considera la investigación es la fijación biológica de nitrógeno”.Actualmente, el grupo de trabajo de in-geniería genética de leguminosas busca desarrollar una sintética experimental de alfalfa tolerante a herbicidas, editada ge-néticamente vía CRISPR/Cas9. “Esto responde a una necesidad a par-tir de la problemática existente con las malezas”, reconoció Soto, quien advirtió sobre la presencia de más de 120 espe-cies de malezas que generan entre un 50 y un 80 % de pérdidas en la producti-vidad potencial en las pasturas de alfalfa en el país.De acuerdo con la investigadora, “la falta de herbicidas selectivos, sumado a la ausencia de cultivares tolerantes y el mal manejo de los lotes intensifica la aparición de malezas resistentes, com-plejizando aún más el panorama futuro”. A lo cual agregó: “En la actualidad, el manejo de lotes de alfalfa con herbicidas es complejo y, por consiguiente, necesita de un alto grado de capacitación”.Edición génica: una herramienta para superar las limitaciones “Combinando técnicas convencionales con herramientas biotecnológicas, como la edición génica, pudimos superar las limitaciones del mejoramiento genético convencional”, aseguró Soto, quien no dudó en resaltar que “el trabajo se foca-lizó en mejorar la productividad y susten-tabilidad del cultivo de alfalfa”.Para eso, “identificamos los caracte-res agronómicos de interés, generamos herramientas moleculares para mejorar y estudiar aspectos relevantes de carac-teres seleccionados tales como la tole-rancia a herbicidas y al estrés abiótico –particularmente la salinidad y el frío–, el retraso de la floración y la fijación bioló-gica de nitrógeno”, detalló la investigado-ra. Y adelantó que, en un futuro, preten-den explorar estrategias que permitan mejorar las performances de los cultivos frente a anegamiento y a sequía.Una vez seleccionados los caracteres de interés, diseñaron las estrategias moleculares para su mejoramiento, vía edición génica. Para lo cual utilizaron he-rramientas bioinformáticas disponibles, como es la reciente secuenciación del genoma de alfalfa y la disponibilidad de microarreglos y otras herramientas bioin-formáticas específicas para la especie.De acuerdo con la técnica, “esta in-formación acorta mucho los tiempos, ya que habilita tanto el estudio como el desarrollo directamente en el cultivo de interés y no indirectamente en especies modelos”.En una primera instancia, se secuenció cada gen a editar para asegurar y dise-ñar guías, que serán las secuencias que dirijan la maquinaria de edición específi-camente a la región que se quiere mani-pular, que hibriden perfectamente con la secuencia deseada (target). Una vez confirmada la secuencia, se diseñaron los guías tomando la precau-ción de elegir aquellos con el menor por-centaje de hibridación con secuencias inespecíficas. De esta forma se minimiza el número de off-targets –genes modifi-cados no intencionalmente–.Luego, para cada uno de los caracteres se siguieron diferentes estrategias. Para el caso de la tolerancia a herbicidas, tanto los genes involucrados como sus mecanismos de tolerancia están amplia-mente estudiados en la literatura y tam-bién por el INTA en alfalfa . En base a toda la información disponi-ble, se eligió la estrategia de mutaciones puntuales dirigidas. Así, se generaron dos vectores binarios para producir mu-taciones puntuales en genes endógenos a través del sistema CRISPR/Cas9. Para esto, se utilizaron vectores que poseen una caspasa, optimizada para plantas, que reconoce las secuencias target, pero que es enzimáticamente in-activa, fusionada a una enzima citidina deaminasa que produce la desamina-ción de las citosinas que se encuentran aguas arribas de la secuencia PAM del gen target. En cuanto al resto de los caracteres, Soto especificó que la estrategia consis-tió en generar knocks outs de genes es-pecíficos, algunos de estos genes fueron 153Agosto 2019, ArgentinaEditar el genoma de la alfalfa para aumentar su rendimientoLa experiencia, líder del proyectoA partir de su reconocida experiencia, el grupo de trabajo de ingeniería gené-tica de leguminosas (IABiMo, INTA-CO-NICET) generó eventos transgénicos de alfalfa en forma efi ciente para, a partir de estos, desarrollar sintéticas experimen-tales y realizar evaluaciones en condi-ciones de invernáculos como en campo. “Según la especie, las estrategias que se usan para obtener organismos gené-ticamente editados son diferentes”, deta-lló Soto. Para el caso de la alfalfa, la edición gé-nica en todos los casos se realizará me-diante el protocolo de transformación vía Agrobacterium tumefaciens y, luego, para los eventos prometedores se realizarán cinco ciclos de cruzamientos manuales con material elite seleccionado por mejo-radores de alfalfa del INTA para obtener una sintética experimental con los carac-teres modifi cados en background genéti-co elite y libre de transgenes.Más información: Gabriela Soto soto.gabrielacinthia@inta.gob.ar; Anibal Pordomingo pordomingo.anibal@inta.gob.ar; Sergio Feingold feingold.sergio@inta.gob.arUna forrajera con numerosas ventajasConsiderada la reina de las forrajeras, la alfalfa se destaca por sus altos rendimientos de materia seca, excelente calidad forrajera, gran adaptabilidad a diversas condiciones ambientales y su capacidad para la fi jación de nitrógeno.Mientras que Córdoba es la principal productora de alfalfa pura, Buenos Aires es la mayor productora de esta forrajera consociada con gramí-neas anuales o perennes. Como especie pura o consociada, la alfalfa integra el 58 % del total de las forrajeras de la Región Pampeana.En esta área, la alfalfa se cultiva casi exclusivamente en condiciones de secano y es la principal especie forrajera del país, así como la base de la producción de carne y leche en la zona.Sus rendimientos promedio en forraje –obtenidos en parcelas de cul-tivos puros correspondientes a la red de evaluación de cultivares del INTA– son de entre 6 toneladas de materia seca por hectárea por año en Anguil, La Pampa, y 20,5 en Marcos Juárez, Córdoba.La extensa distribución que la alfalfa tiene en la Argentina supone un amplio rango de adaptación a las particulares condiciones de precipita-ciones, suelos, temperatura, plagas, enfermedades y modalidades de manejo de cada zona.En los últimos 25 años, se inscribieron cerca de 300 variedades en el Registro Nacional de Cultivares (INASE). Si se descuentan las ob-soletas y las fuera del mercado por diversas razones, los materiales disponibles en el mercado rondan los 130.La alfalfa es considerada la reina de las forrajeras con una extensa distribución en la Argentina.elegidos en base a datos bibliográfi cos y otros en base a estudios en curso en el grupo de trabajo. En todos los casos se eligió el siste-ma modular de vectores multiplex y, a partir de todos estos, se utilizó el sis-tema de clonado Golden Gate a fi n de obtener vectores de expresión para la transformación estable en plantas dico-tiledóneas. Por su parte, los guías fueron diseñados para hibridar en el primer y/o segundo exón del gen target ya que de esta manera aumenta la efi ciencia del knock out. “Se eligieron guías con un score eleva-do y el menor número de off -targets po-sibles”, detalló Soto quien, a su vez, ex-plicó que “en los genes que forman parte de grandes familias se tuvo especial cui-dado en no elegir guías que hibriden con zonas conservadas que pudieran knoc-kear otro gen similar”. Por último, indicó que todas las cons-trucciones generadas, tanto para muta-ciones puntuales como para knock out de genes de interés fueron realizadas por miembros del grupo en la Universidad de California, Davis –Estados Unidos–, en el marco de una colaboración con el la-boratorio del Dr. Eduardo Blumwald.

Editar el genoma de la alfalfa para aumentar su rendimiento

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