Noguchi Kenta

能口 健太

中村学園大学博士令和元年度doctoral thesi

Noguchi, Kenta

5368

能口, 健太

5367

ノグチ, ケンタ

Nakamura Gakuen University: Repository / 中村学園大学学術リポジトリ

－ 1 －                      論文内容の要旨  【目的】プロテインS（PS）Tokushima（PS p.Lys196Glu）と2つのプロテインC（PC）遺伝子変異（PC p.Arg189Trp、PC p.Lys193del）は、それぞれ日本人と中国人で高頻度に認められる遺伝性血栓性素因である。これらの変異アレル保有者ではⅡ型欠乏症を示すため血液検査による診断が困難となっている。本研究では、健康な日本人若年成人女性における、これらの遺伝子変異の頻度と血液検査所見について検討した。また、我々のグループが開発した総 PS 測定系の PS Tokushima 診断特性についても検討した。 【方法】日本人若年成人女性 231 名を対象とした。遺伝子解析は、Real time PCR 法を使用した。血漿解析では、総 PS 測定系による総 PS 活性は比色法、従来法による PS 活性と PC 活性は凝固時間法、抗原量はラテックス法を用いて測定した。それぞれの活性を抗原量で除して比活性を算出した。本研究は本学倫理委員会によって承認され、すべての対象者は研究内容の説明を受け、書面による同意書を提出している。   氏    名 能口 健太  学 位 の 種 類 博士（栄養科学）  学 位 記 番 号 博栄甲第 0023 号  学位授与の日付 令和 2 年 3 月 19 日  学位授与の要件 学位規則第 4 条第 1 項該当（課程博士）  研 究 科 専 攻 栄養科学研究科 栄養科学専攻  学位論文題目 Plasma phenotypes of protein S Lys196Glu and protein C Lys193del variants prevalent among young Japanese women （日本人若年成人女性に高頻度に存在するプロテイン S   Lys196Glu 変異とプロテイン C Lys193del 変異の血液 検査所見の検討）  主論文公表雑誌 Blood Coagulation & Fibrinolysis  論文審査委員 (主査) 中野 修治 (副査) 津田 博子 (副査) 森山 耕成 (外部審査委員) 石倉 宏恭 （福岡大学 医学部） (外部審査委員) 稲井 哲一朗 （福岡歯科大学 口腔歯学部）  － 2 －  【結果】PS Tokushima（p.Lys196Glu）および PC p.Lys193del 変異のアレル頻度は、それぞれ1.08％、0.86％であり、PC p.Arg189Trp 変異は同定されなかった。 PS Tokushima ヘテロ接合体は、総 PS 抗原量は正常だが、総 PS 活性は低値であり、Ⅱ型欠乏症であることが確認された。PC p.Lys193del 変異ヘテロ接合体は、PC 活性は基準範囲内だったが、PC 抗原量は高値だった。PS、PC の活性/抗原量比はそれぞれヘテロ接合体が野生型より有意に低値であった。 Tokushima ヘテロ接合体の診断特性について、総 PS 測定系による総 PS 活性/総 PS 抗原量比と、凝固時間法に基づく PS 活性/遊離 PS 抗原量比で比較した。総 PS 測定系では感度、特異度ともに 100％であったが、凝固時間法ではそれぞれ 100％と 87.7％であった。 【考察】PS Tokushima の変異アレル頻度は過去の日本人についての報告の 0.6～0.9％よりわずかに高かったが、PC p.Lys193del 変異アレル頻度は中国人の 1.2％より低かった。総 PS 測定系を用いた血漿解析は、PS Tokushima の変異アレル保有者を従来法の凝固時間法よりも正確に診断できることを示した。  論文審査結果の要旨  遺伝性血栓性素因として、ビタミン K 依存性蛋白質プロテイン S（PS）の遺伝子変異である PS Tokushima（PS p.Lys196Glu）と 2 種のプロテイン C（PC）遺伝子変異（PC p.Arg189Trp、PC p.Lys193del）を健康な日本人若年成人女性においての頻度と、PS 変異をより正確にスクリーニングする判定法について検討した。対象は日本人若年成人女性 231 名で、遺伝子解析は、Real time PCR 法を使用した。血漿の解析は、総 PS 測定系による総 PS 活性は比色法、従来法によるPS 活性と PC 活性は凝固時間法、それぞれの抗原量はラテックス凝集法を用いて測定した。遺伝子解析により PS Tokushima（p.Lys196Glu）ヘテロ接合体 5 名、PC p.Lys193del ヘテロ接合体 4 名を同定し、アレル頻度はそれぞれ 1.08％、0.86％となったが、PC p.Arg189Trp は同定されなかった。変異アレル保有者と非保有者の解析の結果、PS Tokushima ヘテロ接合体は、総 PS 抗原量 99±10 IU/dL と基準範囲内だが、総 PS 活性は 67±6 IU/dL と低値であり、2 型欠乏症であることが確認された。PC p.Lys193del ヘテロ接合体は、PC 活性 90±17 U/dL と基準範囲内だったが、PC抗原量が 121±23 U/dL と高値だった。PS、PC の比活性はそれぞれ 0.69±0.03、0.75±0.06 とヘテロ接合体が野生型より有意に低値であった。また PS Tokushima の変異アリル保有者の判定においては、総 PS 比活性（総 PS 活性/総 PS 抗原量）は従来の凝固時間法に基づく判定法よりも感度、特異度、AUC が最も高く、正確に診断できることを示した。 以上の研究は、若年日本人女性において PS と PC の既知の遺伝子変異の頻度を明らかにするとともに、PS変異をより正確にスクリーニングする検査法において総PS比活性の妥当性を検証したもので新規性があり、学位論文としては適格であると判断された。   － 3 －  最終試験結果の要旨  申請者に対して、以下の質問を行った。  1)  アレル頻度と保有者の関係について説明せよ。 2)  遺伝性素因保有者が 25 人に一人という計算はどこからか。計算方法を説明せよ。 3)  PS のホモの場合はどうなるのか。 4)  PS、PC の遺伝子変異として今回に示すものの他にあるのか。 5)  遺伝子多型の定義について説明せよ。 6)  ヘテロの場合、変異側と野生側で翻訳に差がでるのか。 7)  血液検体が古いが、理由はあるか。 8)  被検者数の決定方法に統計的な根拠はあるか。遺伝子変異を決定するときに被検者数は妥当か。 9)  PS と PC の測定外注先により基準値が異なるが、今回は問題がないのか。 10) ホモ変異は生存できるのか。 11) 遺伝子多型を持つ者のうち、症状が現れたものはいたのか、追跡はできたのか。 12) 新規測定系で従来法に比べ、活性が高くなると理解していいのか。 13) 遊離 PS のみが APC Cofactor 活性を持つが、総 PS 活性は PS-C4BP を解離して測定している。遊離 PS 活性との相関はあるのか。 14) Total protein S 活性での測定は PT-based protein S 活性測定の方法のうち、臨床上ではどちらの方法で PS 活性を測定するほうが良いのか。 15) Total protein S 活性での測定は PT-based protein S 活性測定と比較し正常型の活性低下者 が減少しており、臨床的には PS Tokushima に起因しない活性低下者を見逃すことになると思 われるが、その点はいかがか。 16) PS Tokushima の感度と特異性が良くなることで、今後 PS Tokushima が見つかる頻度が増える と思われるが、医学的および倫理的配慮はどのようにするのか。 17) Protein C の変異型で抗原量が有意に高いのはなぜか。 18) 論文の考察では DOAC について言及しているが、Total protein S 活性測定において DOAC影響を受けない理由を説明しなさい。 19) PS Tokushima と Protein C Lys193del variant の発現は mutually exclusive なのか。 20) このような PS や PC variant の持つ個人に対し、栄養学的に留意すべき点はあるか。  － 4 －  21) PS 活性の従来法での野生型の低下者は何かフォローをしたのか。測定方法で外れ値があるはなぜか。測定方法に問題はないのか。 22) 新規 PS 測定法で Tokushima の比活性が 0.7 になっている理由はなぜか。 23) PS Tokushima のプローブ配列の設定における pseudogene の存在とその配慮について説明しなさい。  上記のような質問に対して、ほぼ的確な回答が得られた。また、本研究の関連分野に関しても知識を有していると判断された。 審議の結果、最終試験に合格したものと判定された。 

Plasma phenotypes of protein S Lys196Glu and protein C Lys193del variants prevalent among young Japanese women

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日本人若年成人女性に高頻度に存在するプロテインS Lys196Glu 変異とプロテインC Lys193del 変異の血液検査所見の検討

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