Badanie biotransformacji L-alaniny i jej pochodnych metodami izotopowymi

Abstract

Celem mojej rozprawy doktorskiej było badanie mechanizmu odwracalnej biotransformacji L-alaniny i jej fluoropochodnej katalizowanej przez enzym – dehydrogenazę L-alaninową. Do badania mechanizmu posłużyła mi metoda rozpuszczalnikowych, SIE i kinetycznych efektów izotopowych, KIE. W zakres pracy wchodziły syntezy związków selektywnie znakowanych deuterem, które zostały wykorzystane do wyznaczenia efektów izotopowych. Praca doktorska składa się z sześciu głównych części: celów badań, przeglądu literatury, badań własnych, podsumowania i wniosków, części eksperymentalnej oraz bibliografii. Dodatkowo zawarłam wprowadzenie oraz spis dorobku naukowego. W przeglądzie literatury przedstawiłam aktualny stan wiedzy na temat biotransformacji L-alaniny i jej fluoropochodnych. Omówiłam znaczenie biologiczne oraz scharakteryzowałam enzymy będące obiektami moich badań tj. dehydrogenazę L-alaninową (AlaDH, EC 1.4.1.1), dehydrogenazę L-mleczanową (LDH, EC 1.1.1.27), dehydrogenazę mrówczanową (FDH, EC 1.2.1.2) oraz tryptofanazę (Tpase, EC 4.1.99.1). Co więcej, zaprezentowałam wybrane metody syntez izotopomerów koenzymu NADH oraz alaniny i jej halogenopochodnych znakowanych stabilnymi izotopami, a także L-tryptofanu i jego pochodnych. W ostatniej części przeglądu literatury przedstawiłam metodę efektów izotopowych jako potężne narzędzie w badaniu mechanizmów reakcji enzymatycznych. Zawarte opracowanie teoretyczne stanowi wstęp do badań własnych, w których szczegółowo omówiłam metody syntez izotopomeru koenzymu NADH znakowanego deuterem tj. [(4R)-2H]-NADH z udziałem enzymów z klasy dehydrogenaz. Otrzymany związek posłużył mi do syntezy izotopologów L-alaniny i jej fluoropochodnej znakowanych deuterem tj. [2-2H]-L-alaniny i 3-fluoro-[2-2H]-L-alaniny. Następnie uzyskaną fluoropochodną L-alaniny wykorzystałam w syntezie [2-2H]-L-tryptofanu w wyniku sprzęgania z indolem katalizowanego przez enzym tryptofanazę. Jest to rzadki w przyrodzie przykład tworzenia wiązania pomiędzy aromatycznym i alifatycznym atomem węgla. W części kinetycznej wykorzystałam otrzymane izotopomery do wyznaczenia SIE i KIE metodą niekonkurencyjną, opartą na spektrofotometrycznym badaniu kinetyki reakcji enzymatycznych. W celu wyznaczenia efektów izotopowych dla reakcji redukcyjnego aminowania kwasu pirogronowego oraz oksydacyjnej deaminacji L-alaniny i ich fluoropochodnych katalizowanych przez dehydrogenazę L-alaninową przeprowadziłam niezależne pomiary parametrów kinetycznych dla związków natywnych i znakowanych. Zaprezentowałam wartości liczbowe KIE dla L-alaniny, 3-fluoro-L-alaniny, kwasu pirogronowego i kwasu 3-fluoropirogronowego, a także dane dotyczące SIE dla L-alaniny, [2-2H]-L-alaniny, 3-fluoro-L-alaniny i 3-fluoro-[2-2H]-L-alaniny. Dodatkowo przedstawiłam SIE dla redukcyjnego aminowania kwasu pirogronowego i 3-fluoropirogronowego z udziałem NADH i [(4R)-2H]-NADH oraz redukcji kwasu 3-fluoropirogronowego do (R)-3-fluoromlekowego katalizowanej przez dehydrogenazę L-mleczanową. Praca zawiera również analizę i interpretację uzyskanych wyników pod kątem wyjaśnienia mechanizmu reakcji biotransformacji L-alaniny katalizowanej przez dehydrogenazę L-alaninową oraz pewne detale mechanizmu przemiany katalizowanej przez dehydrogenazę L-mleczanową