Die Ausbildung der kontraktilen Myofibrillen ist ein komplexer Vorgang, der die streng kontrollierten Interaktionen vieler Proteine bedarf. Auf der Suche nach Proteinen, die an diesen Prozessen beteiligt sind, stellte sich die Podin-Proteinfamilie als interessanter Kandidat heraus. Deshalb war das Ziel dieser Arbeit die biochemische und zellbiologische Charakterisierung dieser Proteinfamilie, bestehend aus Synaptopodin, Myopodin und Tritopodin, hinsichtlich ihrer Expressionsmuster, Spleißvarianten und Liganden. Die Analyse putativer Isoformen des Myopodins und Tritopodins implizieren eine wesentlich größere Komplexität, als bislang angenommen. Mithilfe von RT-PCR Experimenten sowie spezifischer Antikörper konnte in glattmuskelreichen Geweben die Expression der langen Myopodinisoform a und im Skelettmuskel die kurze Myopodinisoform e nachgewiesen werden. Die Expression von Tritopodin scheint hingegen auf die quergestreifte Muskulatur beschränkt zu sein. Immunhistochemische Färbungen zeigen erstmals die Lokalisation aller drei Podin-Proteine in der adulten sarkomerischen Z-Scheibe. Während Myopodin und Tritopodin bereits in sehr frühen Stadien der Skelettmuskeldifferenzierung exprimiert werden und bereits in Z-Scheibenvorläuferstrukturen mit alpha-Aktinin kolokalisieren, konnte Synaptopodin ausschließlich in adulten Stadien detektiert werden. Aufgrund der Homologie der Podin-Proteine untereinander, werden ähnliche Bindungsverhalten vermutet. Hier konnte erstmals gezeigt werden, dass alle Podin-Proteine mit den Ig-Domänen 20-21 des Filamin C interagieren. Für Synaptopodin war zudem bekannt, dass es mehrere unabhängige Bindungsstellen für alpha-Aktinin besitzt. Ähnliche Bindungseigenschaften konnten hier für Myopodin und Tritopodin nachgewiesen werden. Auch wurde bereits die grundlegende Fähigkeit des Myopodins an F-Aktin zu binden, beschrieben. Hier konnte gezeigt werden, dass Myopodin sogar zwei F-Aktinbindungsstellen besitzt, die in allen putativen Isoformen vorhanden sind. Zudem konnte gezeigt werden, dass Myopodin, ähnlich wie alpha-Aktinin, Aktin zu dicken Bündeln verknüpft. Die Aktinbündelungsaktivität ist dabei nicht nur auf die zwei vorhandenen Aktinbindungsstellen, sondern auch auf die hier erstmals gezeigte Dimerisierung des Myopodins, zurückzuführen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die hier erzielten Ergebnisse deutliche Hinweise auf eine Funktion der Podine als Multiadapterproteine der Z-Scheibe liefern, wobei die ähnlichen Bindungseigenschaften der einzelnen Podin-Proteine eine komplementäre Funktion implizieren. Weiterhin deutet die sehr frühe Expression von Myopodin und Tritopodin in der Skelettmuskeldifferenzierung darauf hin, dass diese Proteine eine wichtige Rolle in der initialen Myofibrillogenese spielen, wohingegen Synaptopodin ausschließlich im adulten Skelettmuskel vorhanden ist.The formation of contractile myofibrils is a complex event that requires the ordered assembly of numerous proteins. Many still unknown protein-protein interactions contribute to this process. While searching for new proteins participating in the assembly of the Z-disc and its dynamic state, the proteins of the podin family were found as interesting candidates involved in these processes. Therefore the aim of this study was the detailed characterization of the podin protein family, consisting of synaptopodin, myopodin and tritopodin, in terms of their expression patterns, splice variants and binding partners. The analysis of the gene structure and the resulting putative isoforms of myopodin and tritopodin revealed a much more complex situation than anticipated. The generation of antibodies against specific parts of myopodin and tritopodin allowed the study of the expression and subcellular localization of the individual isoforms in different cell types and tissues. The expression analysis on mRNA and protein levels indicated that the long myopodin isoform a is expressed in smooth muscle-containing tissues like prostate, whereas the short isoform e is mainly expressed in skeletal muscle tissue. By contrast, the expression of tritopodin seems to be restricted to cross striated muscle cells. Immunofluorescence studies showed for the first time, that all podin proteins are located at the adult sarcomeric Z-disc. While myopodin and tritopodin are expressed in the very early stages of myofibrillogenesis and myotube differentiation, where they colocalize with alpha-actinin, synaptopodin is exclusively expressed in terminally differentiated skeletal muscle cells. The high degree of sequence similarity between the three members of the podin family in defined regions suggests analog binding properties. Indeed, biochemical studies revealed that all podin proteins interact with the Ig-domains 20-21 of filamin C. Similar to the situation in synaptopodin interaction studies showed that alpha-actinin binds also myopodin and tritopodin at multiple binding sites. The previously demonstrated interaction between myopodin and F-actin is actually mediated by two independent actin binding sites, which are found in all myopodin isoforms. Furthermore this thesis demonstrates that myopodin is able to bundle actin filaments similar to alpha-actinin. Interestingly the actin bundling activity is not only achieved by the presence of two F-actin binding sites, but also results from myopodin's ability to dimerise. In conclusion, all podin proteins show analog binding properties, indicating an at least partial functional complementarity of these proteins within the sarcomeric Z-disc. There is evidence that at least two members of the podin protein family, myopodin and tritopodin, are actively involved in myofibrillogenesis, by forming complexes with alpha-actinin and filamin C during the initial stages of myofibril assembly. In contrast, synaptopodin appears to have exclusive functions in fully differentiated tissues
