About 15% of human cancers are caused by viruses. For instance, the particular case of the high-risk human papillomavirus (HPV) is associated with more than 99% of cervical carcinomas. The preventive vaccines for HPV infection available in the market only induce the antibody immunity and are completely ineffective when the infection is already present. Therefore, the problematic associated to HPV infections and tumor progressions continue to be unsolved. Thus, the urge to attenuate the HPV associated lesions led to the development of DNA vaccines.
DNA vaccines emerged as a versatile strategy to induce both humoural and cellular immune immune responses. In addition, plasmid DNA (pDNA) arose as a promising vehicle for gene delivery, due to its simple manufacturing process with high purity degree and low cost, as well as its ability to transfect eukaryotic cells with satisfactory expression levels.
Therefore, in the last years, the growing demand of pharmaceutical-grade pDNA fostered the development of new chromatographic supports, allowing high capacity and selectivity by the supercoiled (sc) pDNA. The innovative monolithic matrices are considered advantageous supports to purify large biomolecules, such as pDNA, due to their tridimensional characteristics of interconnected pores, which allows good mass transfer properties and binding capacity. Amino acid-affinity chromatography has revealed to be a promise approach that selectively recognizes the sc pDNA, since this strategy is based on natural occurrence of multiple interactions between proteins and nucleic acids in biological organisms, which mainly involve basic amino acids such as L-histidine.
Surface Plasmon Resonance (SPR) Biosensor can be used to exploit the interactions between immobilized amino acids and different plasmid topologies to provide further structural information for affinity chromatography purification.
Thus, the aim of this work was to perform a screening of L-histidine amino acid and their derivatives, Im-benzyl-L-histidine and L-methyl-L-histidine, employing the SPR technique in order to modify a monolithic support with the selected ligand, to purify pDNA. Several experiments were performed with three plasmids of different sizes (6.05, 8.70 and 14 kilo base pairs) and different isoforms (open circular, sc and linear), separately. The results revealed that the overall affinity of plasmids to L-histidine ligand and their derivatives was high (KD >10-8 M) and the highest affinity was found for HPV-16 E6/E7/L-histidine interaction, 3.34 x 10-10 ± 0.0209 M. Therefore, L-histidine was selected for immobilization on a monolithic matrix.
After preparation of the histidine monolithic support, chromatographic studies were also accomplished with the aforementioned samples. In general, the sc isoform developed strong interactions with the support and the separation of plasmid isoforms was achieved by decreasing ammonium sulfate concentration. The separation of plasmid isoforms remained unchanged by flow rate variations. The breakthrough experiments of L-histidine monolith revealed satisfactory dynamic binding capacity when compared to other matrices.
Overall, affinity chromatography can benefit from affinity analysis experiments provided by SPR biosensor, and the combination of L-histidine ligand with the monolithic support can be a promising strategy to purify the sc pDNA with the desirable purity degree for pharmaceutical applications, such as the DNA vaccines directed against the HPVs.Cerca de 15% dos cancros em humanos são causados por vírus. Por exemplo, o Vírus do Papiloma Humano encontra-se associado a mais de 99% dos casos de cancro do colo do útero. As vacinas preventivas contra o Vírus do Papiloma Humano existentes no mercado apenas induzem imunidade mediada por anticorpos e são completamente ineficazes na presença de infeção. Deste modo, os problemas associados a infecções pelo Vírus do Papiloma Humano e progressões tumorais continuam a aumentar. A necessidade de atenuar as lesões associadas ao Vírus do Papiloma Humano levou ao desenvolvimento de vacinas de DNA. As vacinas de DNA surgiram como uma estratégia versátil para induzir respostas imunes, quer celulares, quer humorais. Para além disso, o DNA plasmídico (pDNA) surge como um transportador promissor para entrega de genes, uma vez que é produzido de forma simples, com elevado grau de pureza e baixo custo, e apresenta capacidade de transfectar células eucarióticas com níveis de expressão satisfatórios.
Assim sendo, nos últimos anos, os níveis de plasmídeo necessário para aplicações farmacêuticas levaram ao desenvolvimento de novos suportes cromatográficos, com elevada capacidade de ligação e seletividade pela isoforma superenrolada do plasmídeo. As matrizes monolíticas são consideradas ideais para purificar biomoléculas como o pDNA. Estes suportes apresentam estruturas tridimensionais de poros interconectados que permitem a transferência de massa por convecção e fornecem elevadas capacidades de ligação, o que torna estas matrizes inovadoras. Por outro lado, a cromatografia de afinidade com aminoácidos revelou-se uma abordagem promissora devido ao bioreconhecimento seletivo da isoforma superenrolada do pDNA, uma vez que esta estratégia se baseia na ocorrência natural de várias interações entre proteínas e ácidos nucleicos, em organismos biológicos, que maioritariamente envolvem aminoácidos básicos como a L-histidina.
As interações entre aminoácidos imobilizados e as diferentes isoformas de plasmideos podem ser estudadas por ressonância de plasma de superfície (RPS). O conhecimento prévio da afinidade aminoácido/pDNA pode posteriormente ser explorado na purificação através da cromatografia de afinidade.
Desta forma, um dos objetivos deste trabalho é utilizar a técnica de RPS para selecionar o aminoácido L-histidina ou um dos seus derivados, benzil-L-histidina e metil-L-histidina, que tem maior afinidade com o pDNA, para posteriormente imobilizar o ligando mais promissor numa matriz monolítica.
Inicialmente foram realizadas várias experiências de RPS utilizando três plasmídeos de tamanhos diferentes (6,05, 8,70 e 14 quilo pares de bases) e com as isoformas previamente separadas (circular aberta, superenrolada e linear). Os resultados revelaram que, no geral, a afinidade dos plasmídeos para o ligando de L-histidina e seus derivados, era elevada (KD >10-8 M) e a afinidade mais elevada ocorreu com a isoforma linear do HPV-16 E6/E7/L-histidina, 3,34 x 10-10 ± 0,0209 M. Desta forma, a L-histidina foi o aminoácido selecionado para ser imobilizado na matriz monolítica.
Após preparação do suporte monolítico de L-histidina, foram realizados vários estudos cromatográficos com amostras mencionadas anteriormente. No geral, a isoforma superenrolada promoveu interações fortes com o monolito de L-histidina e a separação das isoformas foi conseguida. A separação das isoformas dos plasmídeos não se alterou com variação da taxa de fluxo. Estudos de capacidade de ligação dinâmica do monolito L-histidina revelaram que a sua capacidade de ligação máxima foi 11,03 mg/mL, com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min e uma solução de plasmídeo de 0,05 mg/mL. Estes resultados foram comparados com os valores de capacidade do suporte convencional de L-histidina-agarose, de um monolito não modificado e um monolito modificado com outro aminoácido, a aginina. A maior diferença nos resultados foi verificada com a matriz convencional de L-histidina-agarose, em que a capacidade do monolito de L-histidina foi cerca de vinte e nove vezes maior do que a capacidade da matriz convencional, usando as mesmas condições de saturação. Em relação ao monolito não modificado e à matriz monolítica modificada com o aminoácido arginina, os valores de capacidade do monolito de L-histidina revelaram ser ligeiramente superiores, em ambos os casos.
De um modo geral, a cromatografia de afinidade pode beneficiar das análises de afinidade exploradas por RPS. A combinação do ligando de L-histidina com o suporte monolítico permitiu a separação da isoforma superenrolada do plasmídeo HPV-16 E6/E7
