Deteção de opiáceos em sangue post-mortem por cromatografia líquida de alta eficiência com deteção eletroquímica usando microextração em seringa empacotada

Abstract

Reconhecendo a gravidade dos problemas relacionados com o abuso e dependência de drogas, e porque direta ou indiretamente fazemos parte desse mundo enigmático, tornou-se pertinente o estudo e reflexão de tal problemática. O consumo de drogas remota há inúmeros anos que, quase se pode afirmar que a história das drogas é a história da humanidade. O seu consumo, bem como os seus efeitos e consequências, são um dos problemas de saúde dominantes, constituindo uma das principais situações de risco da população atual. Em Portugal, assim como no resto do mundo, o uso abusivo de substâncias psicoativas cresce a cada dia. Em termos de saúde pública, aumentos significativos no número de ocorrências de óbito com o envolvimento de tais substâncias têm sido reportados nas últimas décadas. Assim, existe uma clara necessidade de responder aos problemas causados pelo consumo de múltiplas substâncias psicoativas. A classe dos opiáceos está figurada entre as substâncias de maior prevalência nesse contexto, como tal torna-se necessário dotar os laboratórios com metodologias mais céleres e eficazes de forma a identificar e quantificar estas substâncias. Assim sendo, neste trabalho pioneiro, descreve-se o desenvolvimento e validação de um método analítico para deteção e quantificação simultânea de opiáceos, morfina (MOR), codeína (COD) e 6-monoacetilmorfina (6-MAM), em amostras de sangue post-mortem, por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à deteção eletroquímica de coulometria (HPLC-ED) usando a microextração em seringa empacotada (MEPS). A hidromorfina (HYMOR) foi utilizada como padrão interno. A elevada quantidade de interferentes biológicos existentes na matriz torna a preparação da amostra um passo fundamental no processo analítico. Desta forma procedeu-se à otimização da técnica extrativa usando o planeamento fatorial fracionado (2k-1), uma ferramenta estatística aplicada ao processo de decisão e que avalia de forma multivariada os fatores intervenientes na extração. O uso do desenho experimental (DOE) fracionado demonstrou ser uma ferramenta útil para a otimização do método de extração, reduzindo o número de experiências, minimizando o tempo de processamento da amostra, reagentes e trabalho laboratorial. As condições finais otimizadas foram o número de aspirações pelo dispositivo (20), quantidade de ácido fórmico na solução de lavagem (3,36%), número de lavagens do sorbente (1), quantidade de hidróxido de amónio na solução de eluição (2,36%) e número de eluições (11). Utilizando um volume de amostra de 250 µL, o método foi validado de acordo com as normas internacionalmente aceites, da Food and Drug Administration (FDA) e International Conference on Harmonization (ICH), para a validação de métodos bioanalíticos. Os parâmetros estudados incluíram a seletividade, modelo de calibração e linearidade, limite de deteção (LOD) e quantificação (LLOQ), precisão, exatidão e recuperação. O método mostrou-se linear na gama de 25 a 1000 ng/mL, com coeficientes de determinação (R2) superiores a 0,99 para todos os analitos. Precisões e exatidões intra- e inter-dia estavam em conformidade com os critérios de validação mencionados, ou seja, coeficientes de variação inferiores a 15% e BIAS dentro de um intervalo de ±15% da concentração teórica. Quanto à recuperação obtida, os valores variaram entre 6% e 23%. O método validado mostrou ser aplicável à análise de amostras reais, sendo então uma ferramenta vantajosa não só no âmbito de análises de toxicologia clinica e forense, mas também em análises de despiste de consumo de heroína, morfina e codeína.By recognizing the severity of problems related to drug abuse and addiction and because directly or indirectly we are part of this enigmatic world, it has become important to study and reflect this problematic. The consumption of drugs remotes to several years ago, so that one might even say that the history of drugs is the history of mankind. Their consumption, as well as the respective effects and consequences are one of the biggest health problems, constituting one of the most risky situations of the current population. In Portugal as also occurs worldwide, the abuse of psychoactive substances is growing each day. In terms of public health, in the last decades significant increases in the number of occurrences of death involving such substances have been reported. Thus, there is a clear need to respond to the problems caused by the abuse of psychoactive substances. The opiates class is figured amongst the most prevalent substances in that context. As such, it becomes necessary to equip labs with faster and effective methods to successfully identify and quantify these substances. Therefore, this pioneer work describes the development and validation of an analytical method for simultaneous determination of opiates, morphine (MOR), codeine (COD) and 6-monoacetylmorphine (6-MAM) in post-mortem blood samples by high-eficiência liquid chromatography coupled to coulometric electrochemical detection (HPLC-ED), using microextraction in packed syringe (MEPS). Hydromorphine (HYMOR) was used as internal standard. The high amount of biological interferences existing in the matrix makes the sample preparation a key step in the analytical process. Thus we proceeded to the optimization of the extraction technique using the fractional factorial planning (2k-1), a statistical tool applied to the decision process that assesses in a multivariate way the factors involved in the extraction. The use of the fractionated design of experiments (DOE) showed to be a very useful tool for the optimization of the extraction method, reducing the number of experiments, minimizing the processing time of the sample, reagents and laboratory work. The final optimized conditions were: number of strokes by the device (20), amount of formic acid in the washing solution (3.36%), number of washes of the sorbent (1), amount of ammonium hydroxide in the elution solution (2.36%) and number of elution (11). Using a sample volume of 250 µL, the method was validated according to internationally accepted standards, the Food and Drug Administration (FDA) and the International Conference on Harmonization (ICH) for the validation of bioanalytical methods. The studied parameters included selectivity, calibration model and linearity, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LLOQ), precision, accuracy and recovery. The method proved to be linear in the range 25-1000 ng/mL with coefficients of determination (R2) greater than 0.99 for all analytes. Intra-and inter-day accuracy and precision were in accordance with validation criteria mentioned above, in other words, coefficients of variation were less than 15% and BIAS within a range of ± 15% of the theoretical concentration. Regarding to the obtained recoveries, the values ranged between 6% and 22%. The validated method was shown to be applicable to the analysis of real samples being an advantageous tool not only within clinical and forensic toxicology, but also in analyses for the screening of heroin, morphine and codeine