Com o crescente interesse na utilização de DNA plasmídico para terapia génica e para formulação de
vacinas de DNA, surgiu a necessidade de estudar e desenvolver esquemas de purificação desta biomolécula.
As tecnologias de separação com membranas são usadas em diversos tipos de processos
a nível das aplicações em biotecnologia, tais como esterilização, separação sólido-líquido, concentração,
troca de tampão e purificação de diversos tipos de moléculas. As técnicas de filtração com
membranas apresentam normalmente vantagens em relação a outras técnicas alternativas como seja
o reduzido impacto ambiental e económico, maior facilidade de aumento de escala (“scale-up”), maior
produtividade dos equipamentos e maior facilidade de automatização e controlo dos processos. Entre
as principais desvantagens contam-se normalmente problemas relacionados com a colmatação das
membranas, os custos de substituição periódica das mesmas e a menor seletividade nas separações
em certos casos.
No âmbito do presente trabalho foi efetuadoumestudo fundamental da transmissão deDNAplasmídico
(pDNA), nomeadamente na forma superenrolada, através de membranas de micro e ultrafitração.
O estudo incluiu a modelação do processo, com base na teoria do transporte restringido de
macrosolutos através de poros estreitos, tendo sido estabelecido um novo modelo para a permeação
de moléculas longas e flexíveis, tais como o pDNA e o RNA.
Estudou-se igualmente a aplicação de membranas ao isolamento de DNA plasmídico a partir de
caldos de fermentação. Nomeadamente foi estudada a microfiltração de lisados e a ultrafiltração dos
permeados de microfiltração obtidos com vista à concentração e purificação do DNA plasmídico antes
da purificação cromatográfica, passo indispensável no processo de recuperação para assegurar
o cumprimento dos padrões de qualidade requeridos pelas agências reguladoras do produto final.
Efetuou-se também um estudo de otimização da operação de ultrafiltração, baseado na otimização
da separação pDNA/RNA.
Os estudos de aplicação realizados permitem perspetivar a utilização da microfiltração e ultrafiltração
nos processos industriais de recuperação de pDNA, como alternativas vantajosas às operações
de centrifugação dos lisados para remoção dos detritos celulares e a operações alternativas no isolamento
intermediário de pDNA, tais como precipitações seletivas com álcoois e sais, extrações líquidolíquido,
entre outras. A microfiltração será vantajosa na medida em que permite o processamento dos
caldos lisados em condições muito mais suaves do que nas centrífugas industriais onde os fluidos estão
sujeitos a fortes tensões de corte que, como é sabido, podem danificar a estrutura dos plasmídeos
irreversivelmente. A ultrafiltração permite eliminar o consumo de grandes volumes de álcoois, tais
como o isopropanol e de sais, tais como sulfato de amónio ou cloreto de cálcio, o que representa uma
enorme vantagem económica e ambiental
