Para explicar o mecanismo de adsorção subjacente à HIC da Angiotensina I foi
efectuada a técnica sob condições lineares. As medidas experimentais foram realizadas
em função do tipo de sal e sua concentração, da temperatura e do tipo de ligando no
adsorvente para a Angiotensina I e seus derivados.
Sob condições isocráticas e a elevadas concentrações de sal, uma característica
da performance da Angiotensina I foi o “broadening” do pico e em muitos dos casos o aparecimento de dois picos. Estes resultados foram interpretados em termos da
isomerização cis-trans da Angiotensina I (polipéptido com um resíduo de prolina) na
coluna seguida de uma “re-conformação” após interacção com o suporte. Foi proposto
que o fenómeno de pico “splitting”, o efeito combinado entre a temperatura,
concentração de sal na fase móvel e o ligando na fase estacionária é causado por
cinética de isomerização lenta que se encontram na mesma escala de tempo que a
separação cromatográfica. A concentração de sal e a temperatura promovem a
conversão da forma trans da Angiotensina I na forma cis, que tem uma maior área
superficial hidrofóbica, em presença do suporte. A retenção da forma trans da
Angiotensina I aumenta de uma força geral com o aumento da concentração de sal na
fase móvel e é afectada ligeiramente pelo efeito da temperatura.
Para além do suporte Butyl-Sepharose referido acima também foram
examinados mais dois suportes hidrofóbicos (Phenyl-Sepharose e Octyl-Sepharose). O
estudo do comportamento da Angiotensina I com os vários suportes indicou um
aumento de retenção com o aumento do comprimento da cadeia n-alquilo do ligando,
observando-se que o ligando aromático phenyl promove a alteração de conformação
(isomerização cis-trans) da Angiotensina I a concentrações salinas mais baixas que nos
outros suportes. Os suportes foram considerados como catalisadores do processo de isomerização cis-trans.
Outro factor também estudado foi a substituição de aminoácidos em posições
distintas da Angiotensina I para utilização em HIC usando a Butyl-Sepharose e tendo
em conta o efeito da concentração de sulfato de amónio. Estes resultados demonstraram
que tanto os aminoácidos da posição 5 como da posição 10 da Angiotensina I se
encontram envolvidos na interacção hidrofóbica. Com base neste trabalho consideramos que a Angiotensina I pode ser um péptido modelo para estudos posteriores em HIC.In order to explain the mechanism underlying the HIC adsorption of Angiotensin
I the technique was run under linear conditions. The experimental measures were done
as function of salt type, its concentration, temperature and type of adsorbent ligand
using as prove peptide Angiotensin I and its derivatives.
Under isocratic elution conditions and at the higher salt concentrations, a
characteristic of the chromatographic performance of Angiotensin I was the broadness
of the corresponding peak and in most of the cases the appearance of two peaks. These
results have been interpreted in terms of on-column cis-trans isomerization of
Angiotensin I (a proline containing polypeptide) followed by its “re-conformation” after
the interaction with the support. It has been proposed that the peak splitting
phenomenon, a combined effect between temperature, salt concentration in the mobile
phase and the ligand, is caused by slow kinetics of isomerization that is on the same
time scale as the chromatographic separation. Salt concentration and temperature
promotes the conversion of the trans form of Angiotensin I into its cis form, which has
a bigger hydrophobic surface area, in presence of Butyl- Sepharose. The retention of the
cis form of Angiotensin I increase with the increase of salt concentration in the mobile
phase and seem not to be affected by temperature. It was further proved that
Angiotensin I is only retarded on the column and not retained.
Besides the Butyl-Sepharose support above mentioned two more hydrophobic
supports (Phenyl-Sepharose and Octyl-Sepharose) were also examined. The study of the
behaviour of Angiotensin I with the various supports indicated an increase of retention
with the increase of the n-alkyl chain length. It was observed the phenyl aromatic ligand
promotes Angiotensin I conformation alteration at lower salt concentration than the
other supports. The supports were considered as catalyst for the isomerization process.
Another factor, also studied was the amino acids replacement in different
positions of Angiotensin I. These results of the adsorption of these peptides in a ButylSepharose column as function of ammonium sulphate concentrations demonstrated that
both, the amino acids in position 5 and 10 of Angiotensin I, are involved in the
hydrophobic interaction.
Based on this work it can be considered that the Angiotensin I is a good peptide
model for further studies in HIC
