Analysis of the outward currents induced by metabolic inhibition

Abstract

Astract: The aim of this work was to investigate whether the inward rectifying current Ik1 participates in the response of the myocardium to metabolic inhibition and to evaluate quantitatively the contribution of IK,ATP to the increase in outward current elicited by metabolic inhibition. The work was carried out on freshly isolated rabbit ventricular myocytes at room temperature using the patch clamp technique in the whole cell configuration. Steady-state currents (Iss) were measured at the end of 400 ms long pulses. The results showed that the current vs voltage relationship in control conditions varied with [K]o, 50 /µM Ba2+ abolished inward rectification of Iss and 30 µM glibenclamide had no effect on Iss in control conditions. This confirmed that the main component of Iss was Ik1 and that IK,ATP contribute to Iss in control. Metabolic inhibition with Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) induced a large time-independent, outward rectifying current which was reversible by washout even at a high concentration of 50 µM. This current was partially (about 45 to 50 %) inhibited by 30 µM glibenclamide. The blockade was time and voltage independent. Fifty micromolar Ba2+ also decreased the GLIB-insensitive component of the current induced by CCCP by about 40% at 0 mV and shifted the reversal potential from -72 to -54 mV. The conductance of this Ba2+ sensitive component at the reversal potential in the presence of CCCP and glibenclamide was higher than that at physiological [K]o in control conditions. Our data suggest that Ik1 was the main component of the CCCP induced current but that Ik1 was also involved in the response. Moreover, the Ik1 conductance seems to have changed and contributes to maintain the resting potential in response to metabolic inhibition. However, neither of these blockers alone nor even both together could not fully reverse the CCCP induced current at potential levels corresponding to the plateau whereas the same concentration of glibenclamide fully reversed the current elicited by a K-ATP channel opener, BRL-38277. The Ba2+ concentration that blocks Ik1 in control and partly inhibits the CCCP induced current had no significant effect on IK,ATP. However, a higher concentration of Ba2+ (100 µM) did partially block the BRL induced current without effect on reversal potential. Therefore, we conclude that Ik1 is the main component of Iss in control conditions and that IK,ATP does not contribute to it. Glibenclamide is a specifie blocker of the K-ATP channel and a low concentration of Ba2+ (50 µM) does not significantly inhibit K-ATP channels. IK,ATP and Ik1 contributed in the response to metabolic inhibition in rabbit ventricular myocytes. However, neither our work nor the work of others carried out in isolated cells could quantify the contributions of IK,ATP and Ik1 to the action potential shortening produced by metabolic inhibition with preservation of glycolysis. On the other hand, other current component(s) not yet identified should participate to fully explain the responses observed in isolated myocytes. || Résumé: Le but de ce travail était de vérifier si le courant à rectification entrante Ik1 participait à la réponse du myocarde à un stress métabolique et d'évaluer la contribution du courant IK,ATP courant sortant déclenché par l'inhibition métabolique. Le modèle expérimental était des myocytes ventriculaires de lapin et la méthode, celle du "patch clamp" en configuration cellule entière. En conditions témoins, la courbe courant voltage du courant au régime établi Iss (à la fin des "puises" de 400 ms de durée) variait en fonction du [K]o, la rectification entrante était abolie par 50 µM Ba2+, et le courant global était insensible à la glibenclamide. L'inhibiteur carbonyl-cyanure m-chlorophenylhydrazone (CCCP) a produit le développement d'un courant à rectification sortant. L'effet était réversible même à haute concentration de CCCP (50 µM). Ce courant était partiellement (45-50%) inhibé par la glibenclamide. La fraction insensible à la glibenclamide était encore réduite par 40% par exposition à 50 µM Ba2+. Le Ba2+ a aussi déplacé le potentiel l'inversion de -72 à -54 mV. La "slope conductance" du courant sensible au Ba2+ au niveau du potentiel d'inversion était plus grande que la valeur témoin en [K]o normal. Nos résultats suggèrent que le courant IK,ATP est la composante majeure du courant induit par l'inhibition métabolique mais que le courant Ik1 était aussi impliqué dans la réponse globale parce que sa conductance au niveau du potentiel de repos était augmentée. L'inhibition partielle du courant induite par CCCP par la glibenclamide et le barium n'était pas dû à un manque de spécificité de ces bloqueurs parce que la glibenclamide a aboli le courant déclanché par un activateur des canaux ATP sensibles tandis que le Ba2+ à faible concentration n'a eu aucun effet sur ce courant. A partir de nos données, nous atteignons les conclusions suivantes: 1. Iki est la composante la plus importante du courant de fonds en condition témoin; 2. Les canaux ATP sensibles sont bloqués par la concentration de glibenclamide employée dans cette étude mais ne sont pas affectés par une basse concentration de Ba2+; 3. les systèmes Ik-atp et Ik1 contribuent à la réponse à l'inhibition métabolique. La contribution de Ik1 explique le maintien du potentiel de repos malgré la perte de K+ cellulaire. A cause des limitations inhérentes aux méthodes employées, il est difficile d'extrapoler les résultats obtenus sur des myocytes isolés aux observations faites sur des préparations multicellulaires en conditions d'hypoxie modérée et préservation de la glycolise anaérobique qui ressemblent d'avantage à des conditions in vivo