Borracci, G.

Conter, M.

Di Ciccio, P. A.

Ghidini, S.

Ianieri, A.

Vergara, A.

Zanardi, E.

Italian

Institutional Research Information System University of Turin

Italian Journal of Food Safety, Vol. 1 N. 3 25 STUDIO PRELIMINARE SULLA DIFFUSIONE DI STAPHYLOCOCCUS AUREUS METICILLINO-RESISTENTE NELLA FILIERA SUINA METHICILLIN - RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS IN PIG PRO-DUCTION CHAIN Conter M.1, Di Ciccio P.1, Zanardi E.1, Ghidini S.1, Borracci G.1, Vergara A.2, Ianieri A.1 1Dipartimento di Produzioni Animali, Biotecnologie Veterinarie, Qualità e Sicurezza degli Alimenti-Università degli Studi di Parma. 2Dipartimento Scienze degli Alimenti – Università degli studi di Teramo.  SUMMARY The aims of this study were (i) to estimate the prevalence of Staphylococcus aureus (S.a) in pig farm environments; (ii) to evaluate the presence of S.a in pork processing environments (iii) to detect the presence of methicillin-resistant (MRSA) among isolated strains. Samples of pig stool, farm environment and pork processing environment were collected. These samples were submitted to detection of S.a following the international method: UNI EN ISO 6888-2 and the Minimum Inhibitory Concentrations (MIC) tests were performed by using the automated VITEK 2 system. In addition, a PCR for the detection of the mecA gene was applied. Overall, S. aureus were more frequently detected from pig farms than from pork processing environments. Among the n.51 isolated strains, n. 49 (96%) were methicillin resistant (MRSA) and only n.2 strains were methicillin sensitive (MSSA). The results of the present study highlighted that further studies are needed to elucidate transmission routes of MRSA in pig production chain. KEYWORDS Staphylococcus aureus, MRSA strains, pig production chain. INTRODUZIONE Staphylococcus aureus (S.a) responsabile di set-ticemie e infezioni a carico di cute, apparato re-spiratorio e tessuti molli, rappresenta anche una delle principali cause di tossinfezione ali-mentare (1). Una importante ed attuale pro-blematica sanitaria legata a S.a è la presenza di ceppi resistenti a diversi antibiotici ed in ma-niera particolare alla meticillina. Il meccanismo principale attraverso il quale i ceppi di S.a di-ventano MRSA è l’acquisizione del gene mec-A che codifica una proteina di membrana alterata denominata Penicillin Binding Protein 2 (PBP2a), caratterizzata da una bassa affinità per la maggior parte dei β-lattamici (2). Le infe-zioni sostenute da MRSA sono riportate in let-teratura da oltre 40 anni, tuttavia nell’ultimo decennio l’aspetto epidemiologico ha subito pro-fonde modificazioni; le infezioni non sono più confinate all’ambiente ospedaliero (hospital ac-quired MRSA, HA-MRSA), ma compaiono con crescente frequenza in soggetti non ospedalizza-ti né esposti a particolari fattori di rischio (community-acquired MRSA, CA-MRSA) (3). Recentemente, inoltre, nel bestiame e in parti-colare nell’allevamento suinicolo, sono stati iso-lati ceppi appartenenti al complesso clonale CC398, geneticamente non correlato ai prece-denti e caratterizzato da una bassa ospite speci-ficità e a rapida diffusione (livestock-associated MRSA, LA-MRSA). Studi olandesi sulla preva-lenza in allevamenti suini di MRSA evidenziano una positività che varia dal 23 all’81%, mentre la prevalenza nei singoli suini varia tra l’11 e il 39%. Dopo l’iniziale isolamento in Olanda, an-che Belgio, Danimarca, Germania, Francia, USA e Canada riportano l’isolamento di MRSA Italian Journal of Food Safety, Vol. 1 N. 3 26 in allevamenti suini; sebbene via sia da sottoli-neare una grande variabilità tra le percentuali riscontrate (4, 5, 6, 7, 8). In un recente Report del 2009 (9), “The European Food Safety Autho-rity” (EFSA) evidenzia come i dati relativi agli MRSA presenti negli allevamenti suini siano a livello europeo limitati. L’ingresso di questi bat-teri all’interno della catena di trasformazione, sfruttando come veicolo gli animali contaminati è uno dei rischi maggiori per la contaminazione delle carni ad opera dei ceppi MRSA incluso il complesso clonale CC398. Gli obiettivi del pre-sente lavoro sono stati:  (i) valutare la diffusione di S.a in am-bienti di allevamenti suini presenti sul territorio parmense;  (ii) valutare la presenza di S.a negli ambienti degli stabilimenti di lavo-razione delle carni;  (iii) individuare la presenza di MRSA tra i ceppi isolati. MATERIALI E METODI Nel complesso sono stati raccolti n.141 campioni da allevamenti suini e stabilimenti di lavora-zione delle carni. In particolare, sono stati cam-pionati: n.6 allevamenti intensivi, dai quali so-no stati raccolti n. 64 campioni (feci e ambienti) e n.2 stabilimenti per la lavorazione delle carni dai quali sono stati effettuati n.77 campioni nel corso di campionamenti successivi (superfici ed attrezzature). Per ciascun allevamento è stato raccolto un campione di un pool di feci prove-nienti da 2/3 box, a seconda delle dimensioni dell’allevamento stesso; mediante sponge-bag preventivamente reidratate con 10 ml di solu-zione di Ringer sono state saggiate, inoltre, le pareti dei box interni, le pareti dei box esterni e le superfici interne delle mangiatoie. I campio-namenti ambientali, presso gli stabilimenti di lavorazione carni, sono stati eseguiti, sempre utilizzando sponge bag, adottando le modalità su descritte. Tutti i campioni sono stati proces-sati in accordo alla metodica: UNI EN ISO 6888-2. I ceppi isolati sono stati sottoposti ad identificazione biochimica mediante sistema au-tomatizzato VITEK2 compact (bioMérieux). La ricerca del 16S rRNA (Staphylococcus genere specifico) e del gene nuc (S. aureus specie-specifico) è stata eseguita mediante multiplex PCR secondo i protocolli di Geha et al. e Brak-stad et al. da noi modificati (10, 11). I ceppi as-segnati alla specie S.a sono stati, infine, saggia-ti per la meticillino-resistenza con metodiche fenotipiche mediante determinazione della MIC con sistema VITEK2 compact (bioMérieux) e genotipiche mediante PCR per l’identificazione del gene mec-A seguendo il protocollo di D’Orio et al., (12). RISULTATI Dai n.141 campioni analizzati sono stati isolati n.51 S.a (36,2%). In particolare, n.50 ceppi di S.a sono stati isolati dai campioni provenienti dagli allevamenti (78,1%) mentre un solo ceppo di S.a è stato isolato dai campioni raccolti pres-so gli stabilimenti di lavorazione (1,3%). Nel complesso n.49 isolati (96%), provenienti tutti dagli allevamenti, sono risultati essere mec-A positivi, mentre n.2, uno da campioni prove-nienti dagli allevamenti e uno da stabilimenti di produzione sono risultati mec-A negativi. Per quanto riguarda la determinazione della MIC per l’oxacillina, n.44 ceppi hanno mostrato un fenotipo di resistenza mentre n.7 ceppi (n.6 ceppi provenienti da allevamenti e n. 1 da stabi-limenti di lavorazione) non sono risultati feno-tipicamente resistenti. CONSIDERAZIONI E CONCLUSIONI Nel complesso è possibile affermare che la pre-valenza di MRSA negli allevamenti suini è con-siderevole. I test per la presenza del gene mec-A sono i metodi più accurati per poter stabilire se un ceppo mostra o meno resistenza alla meticil-lina (oxacillina). Anche se l’espressione del gene mec-A è considerato il principale meccanismo di resistenza alla meticillina negli stafilococchi, altri meccanismi da soli o in combinazione, sono stati rilevati nei ceppi di S.a. Per esempio, la resistenza alla meticillina in ceppi, mecA-negativi può essere legata ad una iperproduzio-ne di β-lattamasi, alla produzione di una PBP con bassa affinità di legame e/o ad altri fattori non ancora identificati (2). I ceppi negativi alla ricerca del gene mec-A, pertanto, dovrebbero es-sere considerati meticillino-sensibili (MSSA) so-lo se alla determinazione della MIC presentano valori ≤ 2µg/ml mentre MRSA se tali valori sono ≥4µg/ml. L’ identificazione del gene mec-A, in combinazione con la determinazione della MIC, sono tecniche in grado di fornire dati attendibili sulla meticillino-resistenza (13). In questo stu-dio dei 49 isolati che veicolano il gene mec-A, 44 erano fenotipicamente resistenti all’oxacillina, ma 5 ceppi mostravano, al contrario, sensibilità a questa molecola. Questi isolati, con ogni pro-babilità, sono ceppi etero-resistenti, in cui meno di 1 cellula batterica su 100.000 è altamente re-sistente alla meticillina (2). Secondo l’interpretazione fornita dal CLSI (2006) è pos-sibile concludere che, in questo studio, il 96% dei ceppi è potenzialmente MRSA. La percen-tuale di positività da noi riscontrata in parago-ne ad altri dati nazionali appare notevolmente più elevata (14); anche se è da considerare che in questa fase preliminare del nostro studio è Italian Journal of Food Safety, Vol. 1 N. 3 27 stato saggiato solo un numero limitato di alle-vamenti. L’ulteriore fase di sviluppo del nostro studio prevede, in quanto di fondamentale im-portanza sia dal punto di vista epidemiologico che per la fonte di infezione, la tipizzazione mo-lecolare dei ceppi MRSA rinvenuti nei vari campioni. In conclusione una conoscenza più approfondita delle prevalenze e delle vie di tra-smissione di ceppi MRSA nella catena alimen-tare potrebbe, sicuramente, fornire gli strumen-ti utili per prevenire la loro diffusione e per po-ter effettuare una corretta valutazione del ri-schio per salvaguardare la salute dei consuma-tori così come sottolineato dal “Report” dell’ EFSA (2009): “Scientific Opinion of the Panel on Biological Hazards on a request from the Euro-pean Commission on Assessment of the Public Health significance of meticillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in animals and foods” (15). BIBLIOGRAFIA -  Kerouanton, A.; Hennekinne, J.A.; Letertre, 1.C.; Petit, L.; Chesneau, O.; Brisabois, A.; de Busier, M.L. (2007). Characterization of Staphylococcus aureus strains associated with food poisoning outbreaks in France. In-ternational Journal of Food Microbiology, 115 (3), 369-375   Baddour, L.M.; AbuElKheir, M.M.; Fatani, 2.A.J. (2007). 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Studio preliminare sulla diffusione di Staphylococcus aureus meticillino-resistente nella filiera suina

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