Bianchi, D. M.

Bottero, Maria Teresa

Civera, Tiziana

Dalmasso, Alessandra

Decastelli, L.

Fontana, E.

Gallina, S.

Gennero, M. S.

Italian

Institutional Research Information System University of Turin

53A.I.V.I. dicembre 2009 n.6VENDITA DIRETTA DI LATTE CRUDO: VALUTAZIONE DI E. SAKAZAKII, COXIELLA BURNETII E M. PARATUBERCULOSISNELL’ESPERIENZA PIEMONTESE RAW MILK AT VENDING MACHINES: EVALUATION OF E. SAKAZAKII, COXIELLA BURNETII AND M. PARATUBERCULOSIS IN PIEDMONT EXPERIENCEGallina S.1, Bianchi D.M.1, Fontana E.2, Gennero M.S.3, Dalmasso A.4, Civera T.4, Bottero M.T.4, Decastelli L. 1(1) S.C. Controllo Alimenti e Igiene delle Produzioni, IZS Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Torino(2) Sezione di Novara, IZS Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Novara(3) Laboratorio Sierologia, IZS Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, Torino(4) Settore di Ispezione degli Alimenti di Origine Animale, Facoltà Medicina Veterinaria, Università degli Studi di Torino, GrugliascoSUMMARY Italian consumers changed their food habits in the last period; the increase of raw milkconsuming is also related to the high number of self service vending machines that havebeen authorized, particularly in Northern Italy. According to national rules on raw milkhygienic conditions, the most important bacteria are checked by Veterinary Services;the aim of this study was to investigate some emerging or re-emerging hazards in rawmilk at vending machines. For this reason 100 raw milk samples were collected and an-alyzed in order to detect E. sakazakii, Coxiella burnetii and M. avium subsp paratuber-culosis. One milk sample resulted to be positive with PCR method for E. sakazakii (nocultural confirmation was possible); 49% of samples resulted posivite for the presenceof Coxiella burnetii specific DNA, and 5% of milk samples came out positive to the pres-ence of M. paratuberuclosis antibodies with ELISA methods.KEY WORDS Raw milk at vending machines, E. sakazakii, Coxiella burnetii, M. paratuberuclosisINTRODUZIONELe abitudini alimentari hanno subito di recentealcuni sostanziali cambiamenti modificando, nel-l’ultimo decennio, il tradizionale paniere alimentare.Questi cambiamenti riflettono in parte la modernasocietà cosmopolita (basti pensare, per esempio, alconsumo di piatti etnici e di preparazioni o prodotti“esotici”); in altri casi, le modifiche alle abitudini ali-mentari sono dettate dalle nuove esigenze delle fa-miglie che trascorrono sempre meno tempo in casae, avendo poco tempo per cucinare, preferiscono ali-menti ready-to-eat, piatti precotti, congelati o refri-gerati. Accanto alle scelte alimentari di tipo socialeo dettate dalla frenesia della vita moderna, si affac-cia prepotente anche una tipologia di consumo ali-mentare cosiddetto “emozionale”, per cui il ritornoal naturale, al biologico, al non trattato fa parte diuna rievocazione del passato che affascina il consu-matore moderno.All’interno di questa spinta emozionale si inse-risce il recente fiorire di distributori automatici dilatte crudo che, a fine 2008, vede autorizzati oltre1100 erogatori sul territorio nazionale (circa 110 inPiemonte). I criteri microbiologici che il latte crudodeve soddisfare sono contenuti nel Reg. CE 853/2004(1) che stabilisce indicazioni specifiche in materia dialimenti di origine animale. Inoltre, la cessione di-retta di latte crudo mediante macchine erogatrici èdisciplinata in dettaglio dalla Intesa Stato Regionidel 25 gennaio 2007 (2). Tale Intesa prevede unaserie di controlli microbiologici da effettuare in au-tocontrollo e da parte degli organi di controllo uffi-ciale, al fine di garantire standard ottimali per ciòche riguarda le caratteristiche igienico-sanitarie delprodotto e di perseguire un elevato livello di prote-zione per il consumatore.In questo lavoro vengono riportati i risultati diun progetto di ricerca che ha voluto indagare la pre-valenza di patogeni emergenti o riemergenti (E.sakazakii, Coxiella burnetii e M.avium subsp para-tuberculosis) valutando la positività in campioni dilatte prelevati alle macchine erogatrici.MATERIALI E METODINell’ambito del progetto di ricerca volta a valu-tare la prevalenza di E. sakazakii, C.burnetii e M.paratuberculosis, sono stati analizzati 100 campionidi latte crudo prelevati al distributore presenti sulterritorio della Regione Piemonte. Il prelievo pressoil distributore è avvenuto in unica aliquota costi-tuita da un’unica unità campionaria. Come descritto in tabella 1 per la ricerca di E.sakazakii sono stati impiegati 3 diversi metodi. Ilprimo di questi è una tecnica end-point PCR (3) cheprevede l’amplificazione di un frammento del gene16 S (952pb) specifico per E. sakazakii. Inoltre èstato applicato un saggio in real-time PCR con l’uti-lizzo di un kit commerciale: entrambi i metodi sonostati applicati ai campioni di latte previa incuba-zione della matrice con BPW (Buffered PeptoneWater – Oxoid) in rapporto 10:90, per 18±2 ore a 37°C. Per l’esecuzione delle analisi volte a determinarela positività per C. burnetii e M. paratuberculosis sisono applicati i protocolli suggeriti dalle ditte pro-duttrici dei kit commerciali, ai quali si rimanda perulteriori dettagli.Le analisi sono state effettuate presso i labora-tori Sierologia e Controllo Alimenti (sedi di Torino eNovara) dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentaledel Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta presso e pressoil Dipartimento di Patologia animale (Settore diIspezione degli alimenti di origine animale) dell’U-niversità degli Studi di Torino. RISULTATIPer quanto riguarda la ricerca di E.sakazakii uncampione ha presentato l’amplificato atteso (952 pb)solamente mediante end-point PCR, identificazioneconfermata anche mediante sequenziamento. Il kitcommerciale in real-time PCR per l’identificazionedi E. sakazakii non ha permesso di identificare nes-sun campione positivo così come l’isolamento micro-biologico con metodo ISO.Dei 100 campioni sottoposti ad analisi con kitReal-time PCR per il rilevamento di Coxiella bur-netii, 49 sono risultati positivi. Tra questi 49 cam-pioni positivi è presente anche il campione già posi-tivo per E. sakazakii. Non è stato possibile includerenello studio metodi biologici di isolamento su colturecellulari di C.burnetii e pertanto i campioni positivinon sono stati confermati con altro metodo.Il kit per la ricerca di anticorpi anti-paratuber-culosis ha permesso di identificare 5 campioni dilatte positivi (5%).A.I.V.I. dicembre 2009 n.654Analisi Metodo utilizzatoE. sakazakiiEnd-point PCR Hassan et al., 2007Realt-time PCR TaqMan®AppliedBiosystemIsolamento microbiologico ISO 22964C. burnetii Real-time PCR TaqVet™ LSI FranceM. paratuberculosis ELISA Pourquier ®Tabella 1: metodi analitici impiegati per l’analisi dei campioni relativamente alla ricerca di microrganismi extrapiano di monitoraggioCONSIDERAZIONI E CONCLUSIONIAd oggi, secondo quanto previsto dal Reg. CE2073/05 (4) e successive modifiche (5), E. sakazakiiè un criterio microbiologico per gli alimenti in pol-vere per lattanti; anche per tale motivo i lavori pre-senti in bibliografia sono incentrati su tali matrici,mentre pochi studi si riferiscono a latte alimentare.Tuttavia, in uno studio condotto su latte di tank nel1999 (6) sono state rilevate percentuali di positividel tutto in linea con i dati ottenuti nel corso dellanostra ricerca. E.sakazakii è stato identificato solomediante PCR e non è stato possibile isolarlo con ilmetodo ISO, probabilmente per una minore sensibi-lità dei metodi microbiologici rispetto a quelli di bio-logia molecolare o alla presenza di forme vitali manon coltivabili.Per ciò che riguarda Coxiella burnetii non esi-stono ad oggi requisiti normativi che ne imponganola ricerca nella matrice latte e in altre matrici ali-mentari. Inoltre, in considerazione del quadro cli-nico modesto o dell’assenza di sintomi eclatanti, èun patogeno raramente ricercato anche in ambito disanità animale e la sua ricerca è limitata a casi incui è forte il sospetto diagnostico o laddove vi sianoindagini epidemiologiche legate ad isolamento in en-docarditi in umana. La ricerca di Coxiella burnetii,inoltre, presenta notevoli difficoltà metodologiche;l’isolamento, infatti, risulta indaginoso e richiede la-boratori attrezzati per l’allestimento di colture cel-lulari. Dalla bibliografia, recenti lavori svolti pressol’IZS Lombardia e Emilia Romagna sulla medesimamatrice latte, hanno evidenziato dati in linea con inostri risultati, con percentuali di positività dal 40%al 47% (7-8). Tuttavia elevate percentuali di positi-vità per Coxiella nei campioni di latte rappresen-tano un potenziale rischio per la salute pubblica alquale per altro si associano episodi di infezioniumane solo in casi sporadici; questa discrepanza puòessere legata al fatto che l’infezione umana com-porta sintomi simil influenzali e quasi sempre au-tolimitanti; solo in alcuni casi si osservato gravi en-docarditi, che impongono spesso interventi di sosti-tuzione delle valvole cardiache. In relazione agli ele-vati valori di positività riscontrati sarebbe oppor-tuno approfondire lo studio confermando le positi-vità in PCR con tecniche di isolamento su colturacellulare. Per quanto riguarda M. paratuberculosis,la sensibilità del metodo utilizzato nel progetto ri-sulta essere non elevatissima (40%; IF 95%: 26%-55%), come già evidenziato da precedenti lavori bi-bliografici (9). Nonostante tali performance il kit harilevato un 5% di positività; la reale prevalenza delM. paratuberculosis non è disponibile in quanto leaziende fornitrici dei distributori automatici non di-spongono di esiti analitici relativi ad indagini pre-gresse per l’isolamento del batterio da materiale fe-cale o per la ricerca anticorpale da siero. Dati bi-bliografici riportano percentuali di positività di-scordanti con valori che vanno da 0.7% di positivitàper indagini eseguite con metodi di biologia moleco-lare (7) a 47% per indagini eseguite con metodicheimmunoenzimatiche (10). Gli studi ad oggi presentitendono ad associare il M. avium sub. paratubercu-losis all’insorgenza del morbo di Chron nell’uomocon conseguente ileite cronica; sebbene questa cor-relazione non sia ancora stata univocamente con-fermata, l’argomento pare degno di ulteriori ap-profondimenti, anche in relazione alla termoresi-stenza del microrganismo.In conclusione il quadro che appare dallo studiorisulta confortante per la bassa prevalenza di E.sakazakii mentre, le elevate positività riscontrateper C. burnetii, necessitano di un approfondimentoulteriore per chiarire l’effettivo rischio per il consu-matore relativamente alla dose infettante e alla pre-senza di microrganismi vivi e vitali.In ultimo pare opportuno segnalare come lescarse positività rilevate per M. paratuberculosis po-trebbero essere oggetto di valutazioni aggiuntive; in-fatti, la scarsa sensibilità della metodica disponibilepotrebbe sottostimare la reale prevalenza del batte-rio. La succitata termoresistenza di M. paratuber-culosis, riportata anche da altri autori (11), inoltre,potrebbe rendere inefficace l’applicazione dell’OM(12), che impone il consumo previa bollitura, non es-sendo il trattamento termico in grado di eliminare ilpatogeno.BIBLIOGRAFIA 1) Reg. (CE) n. 853/2004 Regolamento del Parlamento eu-ropeo e del Consiglio che stabilisce norme specifiche inmateria di igiene per gli alimenti di origine animale.2) Intesa, ai sensi dell’articolo 8, comma 6, della legge 5giugno 2003, n° 131, tra il Governo, le regioni e le Provinceautonome di Trento e di Bolzano in materia di vendita di-retta di latte crudo per l’alimentazione umana. Rep. N.5/C5R del 25 gennaio gennaio 2007.3) Hassan A, Akinedena O, Kressa C, Estuningsihb S,Schneidera E and Usleber E. “Characterization of thegene encoding the 16S rRNA of Enterobacter sakazakiiand development of a species-specific PCR method” In-ternational Journal of Food Microbiology 116 (2007) 214–220.A.I.V.I. dicembre 2009 n.6554) Reg. (CE) n. 2073/2005 della Commissione del 15 no-vembre 2005 sui criteri microbiologici applicabili ai pro-dotti alimentari.5) Reg (CE) N. 1441/2007 della Commissione del 5 dicem-bre 2007 che modifica il regolamento (CE) n. 2073/2005sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari6) Jayarao BM, Wang L. A Study on the Prevalence ofGram-Negative Bacteria in Bulk Tank Milk. Journal ofDairy Science Vol. 82, 1999,No. 12 2620-2624 7) Bertasi B, Maccabiani G, Titola M, Daminelli P, Boni P.Presenza di Coxiella burnetii e M. paratuberculosis nellatte crudo: monitoraggio mediante tecniche di biologiamolecolare. Atti X Congresso Nazionale SIDiLV, 2008, pag103-104.8) Magnino S, Vicari N, Boldini M, Rosignoli C, Nigrelli A,Andreoli G, Pajoro M, Fabbi M. Rilevamento di Coxiellaburnetii nel latte di massa di alcune aziende bovine lom-barde. Large Animal Review, 2009; 15: 3-6.9) Arrigoni N, Belletti GL, Cammi G, Taddei R, PravettoniD, Belloli A, Tamba. Diagnosi di paratuberculosis bovina:valutazione di un test ELISA del commercio si siero dilatte di animali infetti in forma subclinica. Atti VI Con-gresso Nazionale SIDiLV, 2004, pag 167-16810) Nielsen SS, Thamsborgb SM, Houec H, Bitscha V.Bulk-tank milk ELISA antibodies for estimating theprevalence of paratuberculosis in Danish dairy herds. Pre-ventive Veterinary MedicineVolume 44, Issues 1-2, 29March 2000, Pages 1-7.11) Grant IR, Ball HJ, Michael T., Rowe MT. Incidence ofMycobacterium paratuberculosis in Bulk Raw and Com-mercially Pasteurized Cows’ Milk from Approved DairyProcessing Establishments in the United Kingdom. Ap-plied and Environmental Microbiology, May 2002, p. 2428-2435, Vol. 68, No. 5 12) Ordinanza Ministeriale 10/12/2008: “Misure urgentiin materia di produzione, commercializzazione e venditadiretta di latte crudo per l’alimentazione umana”.Gazzetta Ufficiale Repubblica Italiana n. 10, del14/01/2008.Finanziamento Ricerca Corrente 2007 (IZS PLV03/2007)“Valutazione del rischio per il consumatore legato allapresenza di Coxilella burnetii ed Enterobacter sakazakiiin latte crudo e in formaggi freschi a latte crudo”A.I.V.I. dicembre 2009 n.656

RAW MILK AT VENDING MACHINES: EVALUATION OF E. SAKAZAKII, COXIELLA BURNETII AND M. PARATUBERCULOSIS IN PIEDMONT EXPERIENCE.

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