Bellini, Elvio

Bettini, Priscilla Paola

Giordani, Edgardo

Sacchetti, Patrizia

Salvianti, Francesca

Italian

Florence Research

-trFItalus Hortus 13 (6). 2006:78 - 82Analisi genetica e molecolare dell'interazione Pyrus - Cacopsylla pyri peril miglioramento generico del Pero EuropeoFrancesca Salviantit., Elvio Bellinit, Priscilla Paola Bettini2, Edgardo Giordanil e PatriziaSacchetti3tDipartimento di OrtofloroJ'rutticolturct, (Jniversità di Firenze, viale delle ldee 30,50019 SestoFiorentino (FI)2Dipartimento di Biologia Animale e Genetica, (Jniversità di Firenze, via Romana 17, 50125 Firenze3Dipartimento di Biotecnologie Agrctrie, (Jniversità di Firenze, via Maragliano 77, 50114 FirenzeGenetic and molecular analysis ofthe Pyrus - Cacopsylla pyri interac.tion in European Pear breedingAbstract. The molecular interaction between oeartree and the piercing/sucking insect Cacopsylla pyriwas investigated through the construction and charac-terization of cDNA subtracted libraries. Genes exores-sed upon insect infestation were identified in asusceptible and a resistant pear genotype. The twoexpression profiles were found to be different: in theresistant plant more genes involved in the response tobiotic and abiotic stress were activated than in thesusceptible one. The further characlerization of theidentified genes could lead to the development ofmolecular markers associated with tolerance/resistan-ce to Psylla.Key words: Pyrus communis, Cacopsylla pyri, resi-stance, substracted library.IntroduzioneNel corso dell'evoluzione le piante hanno messo apunto complesse strategie di difesa nei confronti diagenti biotici e abiotici. In particolare, per quantoriguarda gli insetti fitofagi, tali meccanismi difensivipossono essere diretti (antixenosi e antibiosi) o indi-retti, costitutivi o indotti. '1'I fitofagi si dividono in due grandi categorie: inset-ti con apparato boccale masticatore ed insetti conapparato boccale pungente/succhiante (o fitomizi). Iprimi danneggiano estesamente i tessuti scatenandouna risposta che porta a sintesi di inibitori delle pro-teasi che interferiscono con la digestione del fitofago.I fitomizi, invece, provocano una risposta molto simi-le a quella che si ha in presenza di microrganismipatogeni attivando due cascate di trasduzione delsegnale, controllate rispettivamente dall'acido salicili-+ fiancesca.salvianti @ unitì.it18co e dall'acido jasmonico ed etilene. La prima porta asintesi di PR proteine (Pathogenesis Related proteins)coinvolte in antixenosi e antibiosi e ad una reazionesistemica detta "Resistenza Sistemica Acquisita"(Sistemic Acquirecl Resistance - SAR); la secondaconduce alla sintesi di altre PR proteine e ad un altrotipo di reazione sistemica chiamata "ResistenzaSistemica Indotta" (lneluced Systemic Resisîance -ISR) (Walling, 2000). I dati riguardanti i fitomizisono ancora scarsi in letteratura e si sa poco sLrglieffetti che I'attacco da parte di tali insetti ha sull'e-spressione genica della pianta (Yuan et a\.,2005).L'obiettivo di questo lavoro è individuare i genicoinvolti nella risposta del pero (genere Pyrus) all'at-tacco da parte della psilla (Cacopsylla pyri L.), uninsetto con apparato boccale pungente/succhiante chearreca gravi danni, diretti e indiretti, alla pianta.Sebbene le conseguenze delle infestazioni di psillasiano estremamente dannose per la pericoltura negliStati Uniti ed in Europa, il sistema Pyrus-Cacopsyllapyri non è stato ancora molto studiato. Soprattuttosono assenti in letteratura ricerche sulla geneticamolecolare dell'interazione fra questo parassita ed i1suo ospite.Materiali e metodiLa strategia adottata ha previsto uno studio dell'e-spressione genica in seguito all'attacco da parte del-I'insetto mediante il confronto tra la reazione di unapianta suscettibile e quella di una resistente. Si è scel-to di lavorare su piante micropropagate in vitro peravere un sistema sperimentale controllabile e ridurreal minimo le possibili variabili. La tecnica presceltaper questo studio è l"'ibridazione sottrattiva"(Suppression SwbÍractive Hybridization o SSH), chepermette di confrontare due popolazioni di mRNA eidentificare i geni che sono espressi in una popolazio-ne e non nell'altra. Per I'ibridazione sottrattiva cisiamo serviti del "PCR-Select Subtraction Kit" (BDBiosciences Clontech), che propone un protocollobasato sulla PCR, più semplice rispetto alle tecnichetradizionali. La tecnica è brevemente descritta in figu-ra 1.L'esperimento ha previsto I'infestazione di pianti-ne geneticamente identiche con individui di psilla invari stadi giovanili e I'uso di altrettante piantine comecontrollo. Dopo 60 ore gli insetti sono stati rimossi,dai due gruppi di piante è stato estratto I'RNA totale esintetizzato il cDNA corrispondente tramite PCR conprimer con sequenza "poli-T". I due cDNA sono statisottoposti a ibridazione sottrattiva ed è stata ottenutauna popolazione di cDNA conispondenti ai geni pre-lèÉf .DNA vtrh .r'lùpbr 'l [ ,vú. .DruÀ I n r{.4eì T.'rLr CDNA *'th rd:ipFr ?g - l€2-,-,,,wl-ffi --Iw--F-"*: ;;.T:ff:i:t".È rrrrrcntlrl dmpLilititionFig. 1 - Descrizione schematica della tecnica di SuppressionSubtractive Hybridíution. Si sintetizza il cDNA delle due popola-zioni a partire dall'RNA totale; si ligano due adattatori diversi alcDNA del campione trattato (tester); si ibridano le due popolazio-ni di cDNA così ottenute con il cDNA del controllo (driver), privodi adattatori: solo le molecole di cDNA differenzialmente espresseresteranno a singola elica; si fa una seconda ibridazione tra i pro- - odotti della prima ed il cDNA di controllo denaturato: in questomodo le molecole di cDNA differenzialmente espresse possonoformare fra di loro ibridi con due diversi adattatori alle estremità.Queste r-rltime molecole vengono amplificate selettivamente permezzo di primer specifici per le sequenze degli adattatori (da:Diatchenko et a|..1996).Fig. I - Description of the "Suppression SubtrauiveHybridization" technique. The cDNA of both populatíons issynthetized from the îotal RNA; two dffirent adapters are ligatedto the cDNA of the treated sample (tester); the two cDNA popuLa-tions are hybridated with the cDNA of the control (driver);without adapters onll' the mrtlecules ofdifferentially expressedcDNA wilL remaín with a singl.e helix; a second hybridization ismade between the products of the first and the denatLrrated controlcDNA: hence the molecul.es of cDNA differentiaLly expressed canform hybrids among fhem with two dffirent adapters at the ends.These molecules are selectively amplíJied by specífic primers forthe sequences of the adttpters (.from: Diatchenko eta1.,1996).Analisi genetica molecolare Pyrus-Cacopsyila pyrÌsumibilmente espressi in risposta all'infestazione.Infine, questi cDNA sono stati clonati. Per verificareche i cloni non fossero "falsi positivi", dato che 1'effi-cienza della sottrazione non è mai del 1007o, sonostate anche fatte ibridazioni di controllo ("dot blot")sui cloni della libreria ufllizzando come sonda lapopolazione di cDNA driver marcata. Come controllonegativo dell'ibridazione è stato usato il vettore talquale. È stata infine determinata la sequenza nucleoti-dica dei cloni differenzialmente espressi. Le sequenzeottenute sono state confrontate con quelle di geni notidisponibili nelle banche dati, al fine di individuareomologie, e depositate nella banca dati GenBank.RisultatiInizialmente è stata messa a punto I'ibridazionesottrattiva su pero della cultivar "William", suscettibi-le alla psilla. Sono stati esaminati 144 cloni dei 218ottenuti. Fra i geni che mostrano omologia con lesequenze di pero (tab. 1) sono particolarmente inte-ressanti le "NAC domain protein", fattori di trascri-zione esclusivi delle piante che vengono espressi inrisposta a patogeni, ferite ed insetti; I'arginina decar-bossilasi. un enzima chiave della biosintesi dellepoliammine (coinvolte nella risposta a stress e a feri-te); ed infine la cinnamil alcol deidrogenasi (CAD),un enzima della via biosintetica della lignina.L'attivazione di questo gene è importante, inquanto la sintesi di lignina è un meccanismo ben notodi risposta ai patogeni e in generale a diversi tipi distress. Risultano inoltre sovraespressi alcuni genicoinvolti nel metabolismo generale (geni per il fattoredi allungamento della traduzione 1cr, per la subunitàbeta della Fl ATP sintasi mitocondriale, per I'argini-na metiltransferasi, per tRNA e per la proteina NAM),probabilmente nell'ambito di una riprogrammazionedel metabolismo della pianta in seguito all'attacco delfitofago.Per verificare che i cloni dei quali si era determi-nata la sequenza nucleotidica corrispondessero real-mente a geni differenzialmente espressi, è stato ese-guito un "virtual nofthern blot" in cui il cDNA tester,trasferito su una membrana di nylon, è stato fatto ibri-dare con due sonde ottenute a partire dai cloni W007e W02l (codificanti rispettivamente il dominio NACe la CAD), presi a campione. Le bande di ibridazioneottenute hanno confermato che le sequenze da noiindividuate sono effettivamente espresse. Lo stessoprotocollo sperimentale è stato applicato sulla selezio-ne di pero "NY10355" resistente alla psilla. Sono statianalizzafi 146 cloni dei 317 ottenuti. Le omologie piùinteressanti riscontrate fra i cloni della libreria e le"t _19ISalvianti ef a/.Clonew006w007w017w020w021wll6w126w130wl37wr39Tab. I - Omologie fia iTab. I - Homologies among theGenBankaccession numberDV4408 I 3DV440814DV4408 t óDV4408 1 9DV44082t)DV440834sequenze disponibili in banca dati sono riportate intabella2.Sulla base dei risultati otteiruti, la selezione di peroresistente alla psilla sembra esprimere molti più genicoinvolti in maniera diretta o indiretta nella risposta dfdifesa delle piante nei confronti di stress biotici e/oabiotici rispetto alla cultivar suscettibile. Fra questipossiamo segnalare in particolare: una proteina similealla metallotioneina, proteina nota per essere indottain risposta a fitomizi, patogeni virali e fungini e ferite;I'enzima 3-idrossi-3-metilglutaril coenzima A redutta-si (HMGR), fondamentale nella biosintesi delle fitoa-lessine di natura terpenoide; la 1-amminociclopropa-no-1-carbossilato sintasi (ACC sintasi), enzima chiavedella biosintesi dell'etilene che ha un ruolo fondamen-tale nella trasduzione del segnale nella risposta a pato-geni, a ferite e ad insetti; un fattore di trascrizionedella famigliabZIP, che interviene nella trascrizione80cloni della lìbreria di cDNA e geni disponibili in banca dati.clones of the cDNA librnry- ttnd tlte available gene.s irt the databttseOrnologia E-valueì'Rect:hia metilcrna tRNA-Leu (trnl-) gene, partial sequence; trnl-'trnF interge-nic spacer. complete sequence; and tRNA-Phe (trnF) gene, pattial secluence; chlo- I 2e-26loplast genes for chloroplast products - GenBank Accession Number: AF367009Glycine nzax NAC| protein (NACI) gene, completc cds.- GcnBank Accession 2.6c-13Number: AY9'74349Arabitlop.sis rhaliana clone RAFL15-0-5-P20 (R20475) putative arginine methyl-transferase (At5949020) rnRNA - GenBank Accession Number: 8T002912P. ltl'brida mRNA encoding NAM protein - GenBank Accession Number: X92205Malus r domestica putative cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) n'rRNA -GenBank Accession Number: AF053084Gl ;-t:ine zar NAC domain protein NACl - GenBank Accession Number:AAY46121I.1e-228e-07l.7e-869e-237.le-108. 1e--54I e--521.5e-35stesso score 0whiclt give theDV440835 Mol.us x clonte,stica auxin-repressed protein like-protein mRNA GenBankAccession Number: AF336307DV440836 Cyanophora pctrttdora elongation translation factor I alpha mRNA. completecds. - GenBank Accession Number: AF09295 IDV440837 Arctbidopsis thuliana nRNA lor mítochonclrial Fl ATP svntln,se beta sttbunit(p-beta gene) - GenBank Accession Number: AJ271468DV440838 Malus .r dontestica MdADC rnRNA for arginine decarboxylase, complete cds. -GenBank Acccssion Number: AB 18 I 8-54'r, E-value: misura della probabilità che l'ornologia sia casuale; è defìnito come il numero atteso di sequenze chc danno louno migliore quando il database è testato con una sequenzir casuale.* E-value: measure o.f the probability tlut the homologt, is due to chance; it is defined as the expected number of setlLtencessame score or a hetter one when the daîabase is tested with a rundom seqlrcnce.di genr di difesa; fattori di trascrizione della famigliaAP2/EREBP (apetala2/Ethylene Response ElementBinding Protein), che intervengono in risposta a stressabiotici e a patogeni.Queste similitudini sono coerenti con i dati presen-ti in letteratura che indicano molti aspetti comuni fiale risposte ai fìtomizi e ai patogeni.ConclusioniDai risultati scaturiti possiamo affermare che igeni notoriamente coinvolti nella risposta difensivavengono indotti in seguito all'infestazione da partedell'insetto sia nella cultivar suscettibile che nellaselezione resistente alla psilla. I dati da noi ottenutievidenziano però una differenza nel pattern di espres-sione genica fra la pianta resistente e la suscettibile.11 lavoro prelude allo sviluppo di marcatori mole--.7Analisi genetica molecolare Pyrus-Cacopsylla pyriTab. 2 - Onrologie tia i cloni della libreria di cDNA e geni disponibili in banca dati.Ttù. 2 - Homolog,ic.s unnng tlte clones tf tlte cDNA librcLrt ctnd tlte uvttilaltle genes in tlte latabuse.GerrBankClone accesslon nLrnì- Or-tlologia F-valucbcr'NYl96 DV.140798 AntirrhinLtnt rrajus mRNA lor bZIP DNA-binding protein GenBank Accession 6. le-33Numbcr': Y13ó76DV4.10807 Artúitlop.tis tholicnta AAA-type ATPase family protein (At'1g28000) rnRNA. complete 2c-08cds. - GenBank Accession Nutnber: NM I1E938DV,140784 Arctbitlopsis îhcrlianu acid phosphatase. pr.rtativc (Atlgl4290) rnRNA. complete cds - 3e-32GenBank Accession Nttmber-: NM 101295DV.1.107"15 ArctbitlLtp.si.s Ílruliana DerlJike family protein / cle-lradation in the ER like firmiì1'prdein 7e-27(Atzlg04860) nrRNA. complete ccls. - GenBank Accession Nunrber: NM I 16724DV,t40737 Arubítlopsis tluilíturu mRNA lor mitochondrial F1 ATP synthase beta subunit (p beta 2e-ll0gene) - GenBank Accession Number': ATH27 l/t6UNYl21 DV440752 Arabidopsi,s thaliunrt rnRNA for SC35-like splicing factor SCL33.33 kD - GcnBank 8.5e-19Accession Number: AJ2937 9L)NYl85 DV44079 I Arabitlopsis tlrulianu putative AP2/EREBP transcription factor - GenBar.rk AccessionNurnber: A4T4494,+NY2IONYI77NYIIINYO29NY I98NY I34NY I09NYI83NY I03NYI72NY146NYOl3NY151DV440769DV44073-5DV440ttlDV440800 Arubitlop.sis îhttlianu putative Col-0 casein kinase I (4t,1g26100) mRNA, completc cds. - 3.5e-13GenBank Accession Number: AY050784DV'+40761 Eupltorbiu c.rrrla LMW heat shock protein rnRNA, complctc cds. - GenBank Acccssion 2.9e-08Nurnber: NF231951DY110141 Hrtrcleum vulgtrre pLrtative cahnodulin binding transporter protein - GenBank 1e-05Acccssion Nurnber: CAA05637DV4,10789 MalLt.s .r domestictr l-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase (ACSI) gene. ACSl- 1.6e-20I allcle . promoter region and partial cds. - GenBank Accession Number: 4Y0621 29DV440739 Mttlus r dontestictt 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMGR) gene, promoter 7e-06rcgion and partial cds. - GcnBank Accession Numbcr: 4F495909DV644003 Metlica.qo.irrtlr,a mRNA for protein phosphatase 1, beta subunit - GcnBank Accession ulc-84Numbcr: 4J002,18-5Metlicctgo.r.7tnrd mRNA fbr protein phosphatase l, delta subunit GenBank Accession 1.le-14Numbcr': 4J002487Or.y-:..tt saÍiva (aponìca cultivar--{roup) Cgi67 serine protease-like - GenBank Accession 7e-22Nur.nber: BAD3781i)Ory,za sutit,tt Qu.ponit;a cultivar'-group) putative beta-amylase - GenBank Accession 2c-23Number: 8AD46222Populus a1úa putative DREB2-like protein mRNA. isolate l. - GcnBank Accession 2e-27Number: AJ833632DV440785 Populus trenula .r Populus rrernuloides retinoblastoma-related protein I (RB1) mRNA,comolete cds. - Ger-rBank Accession Numbct': AF133675DV440738 Poltulus .r canadensís mRNA fbr putative histidine-containing phosphotransfer protein le-'/12 (hpt2 gene), cuìtivar Dorskamp - GenBank Accession Nutnber: AJ84l79'1DV440149 Pyrus pvríÍolitr gene fbr S3-RNase. complete cds. A8025421DV440736 Pt'rus pyrifolírz PPFRUS mRNA fbl metallothionein-like protein - GenBank AccessiouNumbcr: AB02 178-5DV440765 Pvrus p-vrifolia strain Whangkeumbae polypeptide precursor of photosystem Il (PP1) 3e-12'7mRNA. nartial cds. - GcnBank Accession Number: AF195209'r E-value: misura della probabilità che I'ornoìogia sia casuale; è definito come il numero atteso di sequenze che danno lo stesso score ouno migliore quando il drtabasc è testato con una sequenza casuitlc.,.E-t,a!ue:n.eaSureofth.eprobabílity-thatfhelnmoklgvist]uetochant:e:sank s(;ore or a beÍÍer one when the datuba,se is testetl vritlt a random seqL{en(e.NYl15 DY440741NY I78NYI02NYI 17NYO27NYl4I6e-09t.2e-09l.4e-252.4e-8181-Salvianti ef a/.colari associati alla resistenza a psilla che sianoespressi precocemente elo in misura maggiore nellepiante tolleranti e resistenti rispetto alle suscettibili.RiassuntoL'interazione molecolare tra il pero e I'insetto conapparato boccale pungente/succhiante Cacopsylla pyriè stata anaTizzata mediante la costruzione e caratteriz-zazione di librerie di cDNA ottenute in seguito a ibri-dazione sottrattiva. I geni espressi dopo I'attacco del-I'insetto sono stati identificati in un genotipo di peroresistente ed uno suscettibile. I due profili di espres-sione sono risultati diversi: nella pianta resistente piùgeni coinvolti nella risposta a stress biotici ed abioticisono stati attivati, rispetto a quanto avvenuto nellapianta su scettibile. L' ulterior e car atterizzazione deigeni identificati potrebbe condurre allo sviluppo dimarcatori molecolari associati alla tolleranza/resisten-za alla psilla.Parole chiave: Pyrus communis, psilla, analisi sot-trattiva.BibliografiaDrarcunNro L., Lau Y-F.C., Caupnsll A. P., MoQADAM F..Huen..c B., LurveNov S., Lurv.qrov K.. GunsrAYA N..SvsnoLov E.D., Srseenr P.D., 1996. Sttppression sttbtrncîit,elrybridizaîion: a method for generating differentiall,t: regula-ted or îissue-specific cDNA probes and libraríe,s. Proceedìngsof the National Academy of Sciences USA. 93: 6025-6030.YueN H.. CsnN X., Zsu L., He G., 2005. IdentiJication oJ genesresponsive to brown planthopper Nilaport'nta Iugens Sttll(Homoptera: Delphacidae) Jeeding ín rice. Planta, 221:105 112.Walr-iNc L.L., 2000. The m.lriad planÍ responses to herhivores.Journal of Plant Growth Regulation, 19 195-21682

Analisi genetica e molecolare dell&apos;interazione Pyrus-Cacopsylla pyri per il miglioramento genetico del pero europeo

https://flore.unifi.it/bitstream/2158/394518/1/2006%20Pero%20Salvianti%20et%20al..pdf

Analisi genetica e molecolare dell'interazione Pyrus-Cacopsylla pyri per il miglioramento genetico del pero europeo

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Florence Research

Analisi genetica e molecolare dell&apos;interazione Pyrus-Cacopsylla pyri per il miglioramento genetico del pero europeo

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Florence Research

Analisi genetica e molecolare dell'interazione Pyrus-Cacopsylla pyri per il miglioramento genetico del pero europeo