El objetivo del presente trabajo es determinar si la magnetofección puede constituir una alternativa eficiente para la transferencia génica in vitro e in vivo en células maduras del musculo esquelético.Facultad de Ciencias Médica

Hereñú, Claudia Beatriz

Morel, Gustavo Ramón

Mykhaylyk, Olga

Pereyra, Andrea Soledad

Spanish

El Servicio de Difusión de la Creación Intelectual

2012 Noviembre, 3(2): 1-2
TRANSFERENCIA GENICA ASISTIDA POR MAGNETOVECTORES EN MUSCULO 
ESQUELETICO
Autores Andrea Soledad Pereyra MD  1 , Gustavo Morel PhD1, Olga Mykhaylyk PhD2, Claudia Hereñú PhD1
Lugar de Trabajo: 1 Instituto de Investigaciones Bioquímicas La Plata-CONICET, Cátedra de Biología, Facultad de 
Ciencias  Médicas,  UNLP,  Argentina; 2  Institute  of  Experimental  Oncology  and  Therapy  Research,  Technical 
University of Munich, Munich, Germany.
E-mail de contacto: andreapereyra@gmail.com
Introducción
La asociación entre vectores virales y nanotecnología ha posibilitado el desarrollo de nuevas y 
más  eficientes  estrategias  de  transferencia  génica  que  se  posicionan  como  valiosas  e 
innovadoras herramientas para el estudio de procesos fisiológicos y fisiopatológicos como así 
también en la intervención terapéutica. Los sistemas de  transferencia asistida por magnetismo 
combinan  los  principios  de  modernas  tecnologías  sustentadas  en  el  uso  de  nanopartículas 
magnéticas  (NPMs)  y  cuyo  objetivo  principal  es  dirigir  y  concentrar  moléculas  terapéuticas 
complejadas  con  elementos  magnéticamente  activos  en  sitios  diana  de  tejidos  o  sistemas 
utilizando  un  campo magnético.  La  Magnetofección incorpora  a  la  metodología  previamente 
descripta un sistema viral o no viral que actúa como vector para el gen de interés. En el marco de 
nuestra línea de investigación el  desarrollo  de  herramientas  confiables para la  manipulación 
experimental  de  la  expresión  génica  en  las  células  maduras  del  musculo  esquelético  es 
determinante.  Aunque las células musculares esqueléticas pueden ser  receptivas a sistemas 
convencionales  de  transfeccion  in  vitro e  in  vivo ninguno  de  ellos  presenta  el  potencial 
demostrado por los vectores virales en lo que respecta a la transferencia génica. Sin embargo, y 
a  pesar  que  los  mioblastos  inmaduros  son  perfectamente  abordados  por  las  mencionadas 
estrategias,  los  miotúbulos  multinucleados  maduros  son  mayormente  refractarios  y  el  uso 
alternativo de vectores virales ofrece una relativa baja eficiencia. 
Objetivos
El  objetivo  del  presente  trabajo  es  determinar  si  la  magnetofección  puede  constituir  una 
alternativa eficiente para la transferencia génica in vitro e in vivo en células maduras del musculo 
esquelético.
Materiales y Métodos 
Los  experimentos  de  magnetofección    in  vitro   fueron  realizados  en  la  línea  celular  estable 
derivada de musculo esquelético C2C12, tanto en su forma inmadura (mioblastos) como madura 
(miotúbulos).  Los  vectores  virales  utilizados,  RAd-GFP  y  RAd-DHPRBeta1a-EYFP  fueron 
construidos previamente en nuestro laboratorio utilizando el método de los dos plásmidos. Las 
formulaciones  de  NPMs ensayadas  fueron PEI-Mag2 y  Atto550-PEI-Mag2 que  se  encuentra 
conjugada con un tinte fluorescente rojo. La relación elegida de  fgFe de NPM/Partícula Física  
Viral fue de 2,5 teniendo en cuenta referencias bibliográficas. Luego de la incorporación de las 
distintas combinaciones a los cultivos celulares estos fueron expuestos a un campo magnético 
de 300 mT. La eficacia de la transducción fue evaluada 48 hs después  mediante observación 
directa y cuantificación de la fluorescencia en un lector de microplacas. Para los ensayos  in vivo   
se utilizaron ratones machos adultos (22 semanas) de la cepa C57BL/6. Las  intervenciones se 
realizaron en el musculo Soleo derecho e izquierdo de cada animal. En ellos se inyectaron 10 7 
pfu de RAd-GFP y 107 pfu RAd-GFP+Atto550-PEI-Mag2 respectivamente. La relación  fgFe/PV 
ensayada en este caso fue de 4. El miembro trasero izquierdo fue inmediatamente expuesto a un 
campo magnético externo durante 30 minutos. La expresión de GFP fue evaluada 6 días post 
inyección mediante microscopia de fluorescencia.
Resultados
Los  experimentos  de  magnetofección    in  vitro   fueron  realizados  en  la  línea  celular  estable 
derivada de musculo esquelético C2C12, tanto en su forma inmadura (mioblastos) como madura 
2012 Noviembre, 3(2): 1-2
(miotúbulos).  Los  vectores  virales  utilizados,  RAd-GFP  y  RAd-DHPRBeta1a-EYFP  fueron 
construidos previamente en nuestro laboratorio utilizando el método de los dos plásmidos. Las 
formulaciones  de  NPMs ensayadas  fueron PEI-Mag2 y  Atto550-PEI-Mag2 que  se  encuentra 
conjugada con un tinte fluorescente rojo. La relación elegida de  fgFe de NPM/Partícula Física  
Viral fue de 2,5 teniendo en cuenta referencias bibliográficas. Luego de la incorporación de las 
distintas combinaciones a los cultivos celulares estos fueron expuestos a un campo magnético 
de 300 mT. La eficacia de la transducción fue evaluada 48 hs después  mediante observación 
directa y cuantificación de la fluorescencia en un lector de microplacas. Para los ensayos  in vivo   
se utilizaron ratones machos adultos (22 semanas) de la cepa C57BL/6. Las  intervenciones se 
realizaron en el musculo Soleo derecho e izquierdo de cada animal. En ellos se inyectaron 10 7 
pfu de RAd-GFP y 107 pfu RAd-GFP+Atto550-PEI-Mag2 respectivamente. La relación  fgFe/PV 
ensayada en este caso fue de 4. El miembro trasero izquierdo fue inmediatamente expuesto a un 
campo magnético externo durante 30 minutos. La expresión de GFP fue evaluada 6 días post 
inyección mediante microscopia de fluorescencia.
Conclusión
Las células musculares esqueléticas se convierten en estructuras postmitóticas durante estadios 
tempranos de su desarrollo y por tanto el músculo maduro normal no presenta células en división 
activa. Esta condición de tejido estático puede presentarse, en algunas situaciones, como una 
limitante  para  su  manipulación  experimental.  A  pesar  que  los  Vectores  Adenovirales 
Recombinantes  (RAds)  sostienen  una  posición  jerárquica  dentro  de  las  herramientas  de 
transferencia y terapia génica,  la reducida transducibilidad de las fibras musculares maduras 
relacionada con la baja expresión del receptor viral de superficie CAR representa una de las 
mayores  dificultades  a  sortear.  Aquí  la  Magnetofección  se  presenta  como  una  importante 
alternativa  ya  que  la  endocitosis  de  los  RAds  se  produciría  mediante  un  mecanismo CAR-
independiente.  Los  resultados  expuestos  en  el  presente  trabajo  demuestran,  mediante  la 
visualización y cuantificación de la Green Fluorescent Protein (GFP) codificada en el genoma 
viral,  que  el  uso  de  Nanopartículas  Magnéticas  asociadas  a  los  vectores  virales  aumenta 
significativamente la transducibilidad de los mioblastos y miotúbulos de la línea celular C2C12 
bajo la influencia de un campo magnético. De las imágenes obtenidas en el musculo esquelético 
de  ratones  adultos  podría  inferirse,  de  manera  preliminar,  la  capacidad  de  estos 
magnetoadenovectores  para  abordar  las  miofibras  maduras  en  contraste  con  los  RAds  no 
complejados con NPMs.
Por lo tanto, el presente trabajo valida el uso de magnetovectores virales como una eficiente 
herramienta para la transferencia génica magnéticamente asistida en células maduras derivadas 
del musculo esquelético.


Transferencia génica asistida por magnetovectores en músculo esquelético

http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/57058/Documento_completo__.pdf?sequence=1

Transferencia génica asistida por magnetovectores en músculo esquelético

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