Objetivos del trabajo:
1) Generar y caracterizar líneas de iPSCs a partir de eritoblastos de sangre periférica humana de pacientes con Síndrome QT largo e individuos sanos control, por medio de la transducción con vectores virales conteniendo las regiones codificantes de los genes de los factores de transcripción OCT3/4, SOX2, KLF4 y c-MYC.
2) Diferenciar dichas líneas de iPSCs a cardiomiocitos con la finalidad futura de modelar in vitro esta cardiopatía y realizar estudios comparativos a nivel morfológico y funcional entre las células derivadas de individuos sanos y pacientes, así como testear posibles drogas.Facultad de Ciencias Médica

Coeli Goldenberg, R.

Goya, Rodolfo Gustavo

Lehmann, Marianne

López León, Micaela

Spanish

El Servicio de Difusión de la Creación Intelectual

GENERACIÓN DE CARDIOMIOCITOS HUMANOS A PARTIR DE CÉLULAS MADRE 
PLURIPOTENTES INDUCIDAS (IPSCS) GENERADAS A PARTIR DE ERITOBLASTOS DE SANGRE 
PERIFÉRICA
López-León M; Lehmann M; Coeli Goldenberg R; Goya RG
INIBIOLP, FCM, UNLP, 1900. mmicalopezleon@gmail.com
Introducción
La obtención de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) constituye un logro de enorme potencial 
clínico ya que las iPSC pueden diferenciarse a estirpes celulares de interés clínico. En tal sentido la 
generación de cardiomiocitos (CM) a partir de iPSC derivadas del propio paciente resulta de gran 
interés para el tratamiento del infarto de miocardio, ya que el músculo cardíaco adulto posee una débil 
capacidad regenerativa endógena, la cual disminuye con la edad. Los CM derivados de iPSCs para 
terapias de reemplazo celular, podrían solventar potencialmente el problema de la disponibilidad de 
tejido cardíaco humano. También poseen un gran potencial para el estudio de enfermedades 
cardiovasculares humanas por modelaje in vitro, como es el caso del Síndrome QT largo (SQTL), una 
canalopatía arritmogénica caracterizada por una grave alteración en la repolarización ventricular, 
traducida electrocardiográficamente por una prolongación del intervalo QT. Predispone a muerte súbita 
por arritmias ventriculares malignas. A 11 años de la identificación de los principales canales afectados 
en esta enfermedad, se han descrito cientos de mutaciones distribuidas en hasta ahora 10 genes 
relacionados con el síndrome. A pesar de que los modelos animales han contribuido enormemente a 
nuestro conocimiento acerca de los mecanismos moleculares que causan trastornos cardíacos, su uso 
trae aparejada serias limitaciones a causa de la especificidad del genoma humano y la considerable 
diferencia entre la fisiología cardíaca en seres humanos y en animales modelo comúnmente utilizados. 
Por tanto, la posibilidad de generar CM derivados de iPSCs paciente-específicos revela nuevas 
oportunidades para la investigación acerca de los mecanismos de la patogénesis de la enfermedad 
cardíaca genética, y también para el descubrimiento de nuevos tratamientos farmacológicos mediante el 
testeo de drogas in vitro. Actualmente, existe una intensa búsqueda de una fuente de células somáticas 
humanas con alta eficiencia de reprogramación y que al mismo tiempo sea seguro y de simple 
recolección para el paciente. La sangre periférica surge como una fuente promisoria para la generación 
de iPSCs, ya que puede ser obtenida en cantidades suficientes y no requiere de técnicas invasivas. 
Objetivos
1) Generar y caracterizar líneas de iPSCs a partir de eritoblastos de sangre periférica humana de 
pacientes con Síndrome QT largo e individuos sanos control, por medio de la transducción con vectores 
virales conteniendo las regiones codificantes de los genes de los factores de transcripción OCT3/4, 
SOX2, KLF4 y c-MYC.
2) Diferenciar dichas líneas de iPSCs a cardiomiocitos con la finalidad futura de modelar in vitro esta 
cardiopatía y realizar estudios comparativos a nivel morfológico y funcional entre las células derivadas 
de individuos sanos y pacientes, así como testear posibles drogas. 
Materiales y métodos
-Células: se utilizaron eritoblastos de sangre periférica humana colectada de pacientes con Síndrome 
QT Largo, así como de individuos sanos (parientes) como control, para la obtención de líneas de iPSCs 
a partir de ellas. Se utilizó la línea de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) irradiados, como capa 
alimentadora sobre la cual se cultivaron los clones de iPSCs.
-Vectores virales: se utilizó el Kit comercial CytoTuneTM-iPS Sendai Reprogramming (Invitrogen), 
conteniendo 4 vectores basados en una forma modificada y no replicativa del virus Sendai (SeV), para 
entregar y expresar de forma efectiva y segura, individualmente cada uno de los 4 genes de 
pluripotencia hOct3/4, hSox2, hKlf4 y hc-Myc.
-Protocolo de reprogramación celular: Se colectaron 8 ml de sangre periférica de cada persona donante 
mediante el uso de jeringa y aguja en condiciones de asepsia. Se procedió a aislar las células 
mononucleares mediante centrifugación en un gradiente de densidad con Ficoll (GE). Con el objetivo de 
expandir la población de eritoblastos deseada, se sembraron 2x106 células en 2 ml de Medio de 
Expansión en un well de una placa de 12 wells estéril. Se incubó en estufa a 37ºC en una atmosfera 5% 
de CO2, durante 48 hs. Se realizó cambio de medio cada 48 hs y se crecieron las células durante 12 
días. Se procedió a cuantificar la población celular mediante citometría de flujo, usando anticuerpos 
para los marcadores de superficie específicos de eritoblastos CD71 y CD36, para determinar si la 
población se enriqueció en el tipo celular deseado. El día 0 se realizó la transducción de los eritoblastos 
con una multiplicidad de infección (MOI) igual a 10 de los vectores virales Sendai portadores de los 4 
genes de pluripotencia. El día 3 post-transducción se procedió a plaquear las células transducidas sobre 
una capa alimentadora de MEFs irradiados en una placa de Petri de 100 mm de diámetro. Luego de  9-
12 días con cambios de medio correspondientes, emergieron las primeras colonias de iPSCs bien 
definidas. Cuando éstas adquirieron un tamaño considerado apto, fueron repicadas en forma manual 
para su aislamiento, purificación y expansión individual. Las células parcialmente reprogramadas fueron 
raspadas de la placa diariamente.
Mayo 2016 | Vol 6 Nº2
2016 Mayo, 6(2): 1-2
-Caracterización de líneas de iPSCs: Se analizó el cariotipo y el perfil de expresión génica de 
marcadores de pluripotencia por RT-PCR, para lo cual debió extraerse RNA total de las células en 
cultivo, realizar la retro-transcripción de los mARN y llevar a cabo las correspondientes RT-PCR para 
analizar la expresión de los genes endógenos OCT4, sox2, nanog, klf4, rex1, dnmt3b, gdf3, tert, nodal, 
lin28 y dppa4, y de los genes exógenos sev_otc4, sev_klf4, sev_sox2, sev-cmyc y sev_r/f. Se utilizó 
GAPDH como control positivo. Se analizó el inmunofenotipo mediante la evaluación de la expresión de 
de los factores de transcripción nuclear SOX2, NANOG y OCT3/4, TRA1-60, así como de los 
marcadores de superficie TRA1-81/-60 y SSEA-4, mediante citometría de flujo. 
-Diferenciación a cardiomiocitos: se estableció el protocolo de diferenciación de iPSCs a CM utilizando 
una línea celular de iPSCs control generada, crecida sobre Matrigel. El primer paso corresponde a la 
generación de cuerpos embrionarios (CE) formados por 10-20 células. El día 1 de diferenciación se 
realizó la inducción a mesodermo, ensayando 3 condiciones diferentes que varían en la concentración 
relativa de los factores de diferenciación Activina A, BMP4 y CHIR. Se analizó la población celular 
mediante citometría de flujo para los marcadores de células mesodérmicas CD56 y PDGFrα. El día 4 se 
ensayaron 4 condiciones diferentes en el Medio de Inducción a linaje cardíaco, variando la 
concentración relativa de los factores cardiomiogénicos XAV, Dorso y SB. Luego de obtenerse CE 
latentes vistos al microscopio (día 15 aprox.), se determinó la efectividad de la inducción a CM mediante 
la medida de la expresión de Troponina T cardíaca. 
Resultados
Se generaron exitosamente líneas de iPSCs provenientes de 2 pacientes SQTL y un individuo control. 
La expansión de eritoblastos resultó ser efectiva en la mayoría de los casos, mostrando una población 
celular aproximadamente 95% doble positiva para los marcadores CD36 y CD71 entre los días 9-12. 
Las líneas de iPSCs fueron caracterizadas mostrando un cariotipo normal (46 cromosomas) y la 
expresión esperada del set de genes endógenos de pluripotencia por RT-PCR. Aquellos clones que 
mostraron expresión de genes de pluripotencia exógenos, debieron ser expandidos a fin de aumentar el 
número de pasaje y diluir el virus hasta perder dicha expresión. El inmunofenotipo analizado por 
citometría de flujo mostró un alto porcentaje de células positivas para los factores de transcripción y 
marcadores de superficie específicos de células pluripotentes. Se estableció el protocolo de 
diferenciación de iPSCs a CM, obteniéndose una población 18.1-49.3% CD56/ PDGFrα positiva al 
evaluar la inducción a mesodermo al día +3 para las 3 condiciones ensayadas, y una población 20.7-
50.2% expresando Troponina T al evaluar la eficiencia de diferenciación cardíaca al día +15 para una 
única condición (XAV) en la inducción a linaje cardíaco de las 3 ensayadas, mientras que para las 
restantes condiciones la expresión fue 9-21% o nula. 
Conclusión
El protocolo utilizado permite la obtención de líneas de iPSCs a partir de eritoblastos de sangre 
periférica humana, obtenidos del paciente en cantidad suficiente y mediante una técnica no invasiva. 
Los eritoblastos poseen claras ventajas frente a otras fuentes de células somáticas a reprogramar. Se 
logró establecer un protocolo de diferenciación hacia CM, haciendo posible entonces el modelaje in vitro 
paciente-específico de la cardiopatía SQTL para el estudio de los mecanismos de dicha enfermedad y 
para un posible testeo de drogas.
Mayo 2016 | Vol 6 Nº2
2016 Mayo, 6(2): 2-2


Generación de cardiomiocitos humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) generadas a partir de eritoblastos de sangre periférica

http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/55659/Documento_completo.pdf?sequence=1

Generación de cardiomiocitos humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) generadas a partir de eritoblastos de sangre periférica

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