En los últimos años, un nuevo paradigma se ha incorporado al estudio farmacocinético de diversos grupos de drogas con la participación de diferentes transportadores celulares de membrana en los procesos de absorción, distribución tisular y excreción de compuestos farmacológicamente activos.
De todos los transportadores celulares identificados, la glicoproteína-P (gp-P) ha sido la más estudiada. Si bien la gp-P fue inicialmente descripta por su sobreexpresión en células tumorales resistentes a múltiples drogas anticancerígenas, también se localiza en células normales de tejidos involucrados en los procesos de absorción, distribución, y excreción de fármacos (Ballent et al., 2005). Esta proteína actúa como una bomba de eflujo que es capaz de bombear una amplia gama de compuestos hacia el exterior celular por un proceso dependiente de energía. La localización específica en estos tejidos sugiere que la gp-P cumpliría un importante rol en la regulación del transporte de fármacos, modificando de este modo el comportamiento cinético y la biodisponibilidad de los mismos (Schinkel, 1997).Trabajo galardonado con el Premio Fundación Pérez Companc, versión 2011Academia Nacional de Agronomía y Veterinari

Alvarez, Luis

Ballent, Mariana

Entrocasso, Carlos

Lifschitz, Adrián

Lloberas, Mercedes

Maté, Laura

Sallovitz, Juan

Virkel, Guillermo

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El Servicio de Difusión de la Creación Intelectual

448
Estrategias farmacológicas contra la resistencia a
drogas antihelmínticas en ovinos:
Modulación in vivo de la glicoproteína-P en el huésped y
en los parásitos resistentes
Lifschitz Adrián1,2; Virkel Guillermo1,2; Lloberas Mercedes3;
Alvarez Luis1,2; Entrocasso Carlos3; Ballent Mariana1,2;
Sallovitz Juan1; Maté Laura1,2.
1. Laboratorio de Farmacología, Dpto. de Fisiopatología, Facultad de
Ciencias Veterinarias, UNCPBA.
2. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET).
3. Laboratorio de Parasitología, EEA INTA Balcarce
.
La población mundial se encuentra en constante crecimiento y ello implica un
aumento en la demanda de alimentos. Según estimaciones de la FAO, para el
año 2050 la población mundial será de 9500 millones de habitantes y la
globalización de los modelos de consumo de alimentos necesitan de una
mayor producción de carne y leche. El aumento de la productividad de los
diferentes sistemas ya sea bovinos u ovinos necesitan de un control eficiente
de las enfermedades que afectan a los rumiantes. El control de las
enfermedades parasitarias constituye una de las principales medidas para
disminuir las pérdidas clínicas y subclínicas que ellas producen. Aunque en
los últimos años estrategias alternativas han sido desarrolladas (vacunas,
hongos nematófagos, animales resistentes), el uso de drogas antiparasitarias
sigue siendo la herramienta más importante para el control de nematodos en
las diferentes especies pecuarias. Ivermectina (IVM) es el fármaco
antihelmíntico más utilizado para el control de parásitos en bovinos y ovinos.
IVM pertenece a la familia de las lactonas macrocíclicas y se caracteriza por su
amplio espectro contra endo y ecto parásitos. IVM, al igual que las restantes
lactonas macrocíclicas, son moléculas grandes de elevada lipofilicidad que le
permite llegar en altas concentraciones a su sitio de acción (McKellar y
Benchaoui, 1996, Lifschitz et al, 2000). Desde su introducción en el mercado
farmacéutico veterinario en 1981, IVM ha sido ampliamente utilizado contra
endo y ectoparásitos convirtiéndose rápidamente en una de las principales
drogas en todo el mundo (Crump y Otoguro, 2005).
El efecto farmacológico obtenido tras la administración de una droga depende
de la interacción de ésta con su receptor (fase farmacodinámica). Para obtener
un efecto farmacológico óptimo son necesarias concentraciones efectivas del
449
fármaco en el sitio de acción (biofase) durante un cierto período (Lanusse y
Prichard, 1993). De esta manera, los procesos de absorción, distribución,
metabolismo y excreción (fase farmacocinética) influyen directamente en las
concentraciones de droga que alcanzan el sitio de acción y, por lo tanto, en su
efecto farmacológico. Mientras que los procesos de absorción y distribución
determinan el pasaje del fármaco desde su sitio de administración hacia la
circulación sistémica y su llegada a la biofase, los procesos de
biotransformación (metabolismo) y excreción determinan la finalización de la
acción del fármaco en el organismo (Riviere 1999).
En los últimos años, un nuevo paradigma se ha incorporado al estudio
farmacocinético de diversos grupos de drogas con la participación de diferentes
transportadores celulares de membrana en los procesos de absorción,
distribución tisular y excreción de compuestos farmacológicamente activos.
De todos los transportadores celulares identificados, la glicoproteína-P (gp-P)
ha sido la más estudiada. Si bien la gp-P fue inicialmente descripta por su
sobreexpresión en células tumorales resistentes a múltiples drogas
anticancerígenas, también se localiza en células normales de tejidos
involucrados en los procesos de absorción, distribución, y excreción de
fármacos (Ballent et al., 2005). Esta proteína actúa como una bomba de eflujo
que es capaz de bombear una amplia gama de compuestos hacia el exterior
celular por un proceso dependiente de energía. La localización específica en
estos tejidos sugiere que la gp-P cumpliría un importante rol en la regulación
del transporte de fármacos, modificando de este modo el comportamiento
cinético y la biodisponibilidad de los mismos (Schinkel, 1997). La Figura 1
muestra la influencia de las proteínas transportadoras como la gp-P en el
proceso farmacocinético de diferentes drogas.
Figura 1
450
El comportamiento farmacocinético de IVM ha sido estudiado en profundidad
en diferentes especies. La elevada eliminación fecal de IVM como droga madre
estaría dada por procesos de secreción biliar e intestinal mediados por gp-P
(Lifschitz et al, 2000, Laffont et al., 2002). En este contexto, la co-administración
in vivo de IVM y otras drogas relacionadas con agentes que interfieran con la
actividad de gp-P (agentes moduladores) ha sido evaluada en diferentes
especies (Lifschitz et al., 2002, Lifschitz et al., 2004, Ballent et al., 2007,).
Loperamida (LPM) es un derivado opiáceo que se ha clasificado como un
modulador de gp-P (Schinkel et al., 1996). La co-administración de LPM junto a
los antiparasitarios IVM o moxidectin (perteneciente al igual que IVM al grupo
de drogas llamado lactonas macrocíclicas) produjo cambios farmacocinéticos
en ratas y en bovinos sin ningún efecto tóxico (Lifschitz et al., 2002, 2004). Tras
la coadministración con el modulador de gp-P (LPM), no solo se aumentaron
las concentraciones del antiparasitario en el plasma sino también en los sitios
de localización parasitaria. La Figura 2 muestra las concentraciones
plasmáticas de moxidectin (a) en bovinos y de IVM (b) en ratas luego de la
administración del antiparasitario solo o coadministrado con LPM.
Además de su rol en la farmacocinética de drogas de diferentes especies de
mamíferos, la gp-P tiene una importante implicancia en los mecanismos de
resistencia a diferentes tipos de fármacos. La gp-P fue inicialmente descripta
por su sobreexpresión en células tumorales resistentes a múltiples drogas
anticancerígenas (Ling Thompson, 1974). Evidencias posteriores condujeron
a proponer que el eflujo mediado por gp-P sería un posible mecanismo de
resistencia antiparasitarios como IVM por parte nematodes, reduciendo la
concentración del antiparasitario en el sitio de acción en el parásito. (Prichard
y Roulet 2007). El problema actual de la resistencia a los diferentes grupos de
antipasitarios es un tópico que preocupa en los diferentes países con
importantes producciones de bovinos y ovinos. Tras varios años de uso intensivo
de IVM para optimizar la productividad de diferentes sistemas pecuarios, la
inevitable aparición de resistencia hacia esta droga ha ocurrido por parte de
diferentes géneros parasitarios (Geary, 2005). En la actualidad, la resistencia
a IVM y otros compuestos relacionados se ha generalizado en los nematodes
de los pequeños rumiantes y se está convirtiendo en una seria preocupación
en los parásitos gastrointestinales que afectan a los bovinos (Anziani et al.,
2004). Teniendo en cuenta el complejo proceso que implica el descubrimiento
e introducción de nuevas drogas antiparasitarias al mercado farmacéutico
veterinario, la alta tasa de resistencia a las moléculas existentes es una seria
amenaza para los diferentes sistemas extensivos de producción pecuaria.
451
Figura 2
Figura 2
452
Teniendo en cuenta que no existen evidencias suficientes sobre el impacto
que este tipo de interacción farmacocinética puede tener sobre la eficacia in
vivo frente a nematodes resistentes en ovinos, la modulación de la actividad de
la gp-P en el huésped y en parásitos resistentes constituye una herramienta
farmacológica muy importante para entender estas complejas interacciones
biológicas. Para llegar a una mejor comprensión, esta problemática puede ser
abordada utilizando diferentes metodologías in vivo y ex vivo que permiten
profundizar los resultados obtenidos. El estudio en un ensayo estandarizado
de los cambios inducidos por la coadministración de LPM como modulador de
gp-P tanto en la disposición plasmática de IVM y en su eficacia en corderos
infectados naturalmente con nematodes gastrointestinales junto con la
evaluación de la actividad intestinal de gp-P utilizando la técnica de las cámaras
de Ussing permitió obtener un importante avance en el estudio de este tipo de
interacciones. Adicionalmente la utilización de las técnicas de biología molecular
para el estudio de la gp-P en las cepas de parásitos resistentes (H.contortus)
permite correlacionar dicha expresión con los resultados obtenidos en el ensayo
fármaco-parasitológico. La Figura 3 muestra el abordaje integral en el estudio
de la modulación de la gp-P en los ovinos y en los nemátodes resistentes
como H. contortus
Figura 3
453
La evaluación de la interacción in vivo se realizó a través de un estudio fármaco-
parasitológico estandarizado utilizando ovinos infestados naturalmente con
parásitos resistentes a la IVM. Luego de administrar a la IVM sola y junto con
LPM como modulador de la gp-P se tomaron las muestras de sangre para
caracterizar las concentraciones plasmáticas del antiparasitario a lo largo del
tiempo. La disponibilidad sistémica de IVM en el torrente sanguíneo (medida
como valores de área bajo la curva) se incrementó un 48 % después de la
coadministración con LPM (Figura 4), lo que concuerda con la mejora obtenida
en los trabajos previos en ratas (Lifschitz et al., 2004) y bovinos (Lifschitz et al.,
2002, 2010). De esta manera se corroboraron las modificaciones
farmacocinéticas tras la co-administración de IVM con el modulador de gp-P
(LPM).
Figura 4
El mecanismo de interacción de la IVM puede estudiarse a través de los
experimentos ex vivo con las cámaras de Ussing. Esta metodología permite
estudiar el transporte de sustancias a nivel intestinal pudiendo caracterizar el
movimiento de las mismas desde la mucosa hacia la serosa intestinal (proceso
de absorción) o desde la serosa hacia la mucosa intestinal (proceso de
secreción). En presencia de una elevada actividad de proteínas transportadoras
como gp-P a nivel intestinal, el proceso de secreción de sustratos de esta
proteína transportadora es cuantitativamente mayor que el de absorción. Se
454
corroboró la importancia del eflujo intestinal mediado por gp-P en el intestino
de ovinos y la interacción de la IVM con la gp-P intestinal mediante un novedoso
sistema ex -vivo que permite estudiar este tipo de fenómenos con precisión. La
alta afinidad de la IVM por la gp-P se caracterizó al disminuir el eflujo intestinal
del tradicional sustrato de esta proteína transportadora, rodamina 123, en
presencia del antiparasitario. La Figura 5 muestra las bases que fundamentan
el uso de las Cámaras de Ussing para estudiar el transporte intestinal mediado
por proteínas transportadoras como gp-P.
Figura 5
La búsqueda de la interacción entre drogas antiparasitarias como la IVM y la P-
gp no solo en el huésped sino también a nivel del parásito fue previamente
abordada en estudios in vitro con estadios larvarios y en animales de
laboratorio. Los datos obtenidos en estudios in vitro con estadios larvarios que
muestran una interacción a nivel del parásito deben ser confirmados con
ensayos in vivo realizados en condiciones de campo. Además de las
modificaciones farmacocinéticas obtenidas, la co-administración de IVM junto
a LPM resultó en una mayor eficacia contra nematodes gastrointestinales
455
resistentes. La reducción de huevos en materia fecal fue de 78.6 % luego del
tratamiento con IVM sola y del 96% cuando se administró junto con LPM. Por
otra parte la reducida actividad IVM en contra de algunas especies de nematodes
fue confirmado en la prueba de eficacia controlada. Haemonchus spp demostró
ser muy resistente a la IVM (totalmente ineficaz con una eficacia de 0%). En el
intestino delgado, se observó una reducida eficacia de IVM (inferior al 90%)
contra Trichostrongylus colubriformis (77.9%). Tras la coadministración con
LPM la eficacia frente a Haemonchus spp y Trichostrongylus colubriformis
aumentó hasta 72.9 y 96.3%, respectivamente (Tabla 1).
 Dentro de los potenciales mecanismos propuestos de resistencia a las
lactonas macrocíclicas como IVM un mayor eflujo de droga mediado por la gp-
P en el parásito ha sido propuesto (Xu et al, 1998; Kerbouef et al, 2002). Para
evaluar la posible participación de la gp-P en la resistencia a IVM por parte de
los nematodes presentes en los ovinos usados en este trabajo, se utilizó
como modelo a Haemonchus spp y se evaluó la expresión de esta proteína
transportadora en comparación a la obtenida en una cepa susceptible de éste
parásito utilizando técnicas de biología molecular. La expresión de gp-P en
Haemonchus spp resistente a IVM recuperados de ovinos infestados fue
significativamente mayor (3.13 veces) que la obtenida en los adultos
recuperados de los ovinos infestados con una cepa susceptible. Los
acontecimientos fármaco-parasitológicos que tienen lugar después de la
modulación de la gp-P en el hospedador indican que la modulación in vivo del
transporte de drogas como la IVM mediado por gp-P no solo puede ocurrir en el
huésped sino también en los parásitos que infestan a los animales tratados.
Esto adquiere importancia teniendo en cuenta, tal como se demostró en el
presente trabajo, que parásitos resistentes como Haemonchus sobreexpresan
a la gp-P.
 Tabla 1
456
La integración entre la información fármaco- parasitológica es importante para
mejorar la comprensión de la relación entre la farmacocinética de las drogas y
su eficacia. Dado el creciente problema de resistencia a diferentes drogas
antiparasitarias usadas en bovinos y ovinos, resulta crucial encontrar
herramientas que optimicen el uso de las mismas en los diferentes sistemas
de producción. El impacto de la modulación de la gp-P en corderos naturalmente
infectados pudo ser corroborado in vivo y los mecanismos de interacción de
IVM con este transportador en el intestino de ovinos han sido estudiados por
métodos ex – vivo. Teniendo en cuenta que las diversas gp-Ps que expresan
los parásitos (Williamson y Wolstenholme 2011)  presentan algunas diferencias
con la de los mamíferos, se abre el enorme desafío de desarrollar inhibidores
específicos de estas proteínas a nivel parasitario que no interaccionen con
transportadores del huésped, evitando cualquier interferencia con otras
funciones fisiológicas. Aunque es necesario seguir profundizando antes de
disponer de herramientas de uso práctico, los resultados aquí presentados
son una fuerte evidencia de que la modulación in vivo de gp-P puede ser útil
para prolongar la eficacia de algunos de los compuestos antiparasitarios, al
menos en las primeras etapas de desarrollo de resistencia.
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Estrategias farmacológicas contra la resistencia a drogas antihelmínticas en ovinos: modulación in vivo de la glicoproteína-P en el huésped y en los parásitos resistentes

http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/27830/Documento_completo.pdf?sequence=1

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