Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica
Abstract
Acute respiratory infections (ARIs), among which the most frequent pathologies\ninclude pneumonia, bronchiolitis and influenza-like illness, affect the whole, but\nespecially people under 5 and over 65. It is among the leading causes of mortality\nworldwide. In Argentina, ARIs are the leading cause for consultation and\nhospitalization in all ages, and in Santa Fe they accounted for nearly 20% of admissions\nat the local pediatric referral hospital in 2010. The most common IRA-causing viral\npathogens are respiratory syncytial virus (RSV), influenza, parainfluenza, adenovirus,\nmetapneumovirus, coronavirus and rhinovirus.\nHuman rhinovirus (HRV) belongs to the family Picornaviridae. They are nonenveloped\nspherical viruses and their genome is a single positive-sense RNA linear\nmolecule which is coated by a capsid of icosahedral symmetry. First isolated in 1956,\nover 100 different serotypes are currently known which are grouped into three\nspecies, HRVA, HRVB and HRVC. They are heat stable and can spread through\ncontaminated respiratory secretions through direct contact between people. They may\nbe found in people of all ages and are spread worldwide. Although their frequency of\ncirculation is usually higher in autumn and spring, they can be detected in every month\nof the year. While historically considered upper airways pathogens, they have recently\nbeen shown to cause infections in the lower respiratory tract as well, causing\nhospitalizations of children with pneumonia, bronchiolitis and chronic pulmonary\nobstruction. They are also associated with patients with recurrent episodes of\nwheezing, asthma exacerbations, bronchitis, sinusitis and acute otitis media.\nVirological diagnosis is needed to determine the etiology of ARIs, since the clinical\nsymptoms caused by each of these viruses are often similar. In addition, the\nunnecessary use of antibiotics can be thus restricted. Viral isolation in tissue culture\nfollowed by an acid liability test represents the standard method in the laboratory for\nconfirmation of HRV infection, but the time required is longer than two weeks, which\nis of limited value for therapeutic decision. Techniques based on the detection of\nnucleic acids through chain reaction (PCR) have led to advance in ARI identification.\nThe fact that no HRV-related studies have been conducted in Santa Fe so far led to\nthe completion of this work, which aims to select and optimize a PCR technique\nenabling the detection of the virus in ARI hospitalized pediatric patients during THE\nmarch 2010-february 2011 period, and then study their frequency, seasonality and\nepidemiology, as well as clinical and epidemiological aspects of infected patients.\nIn order to develop the study, a highly sensitive and specific nested RT-PCR was\nselected which was tested by Steininger et al. (2001) for most known HRV serotypes,\namplifying a highly preserved fragment of the viral genome. Technique was optimized\nwith positive virus controls, varying critical test parameters, and specificity was\nthereby confirmed by testing positive controls of other respiratory viruses.\nA total of 2020 nasopharyngeal aspirates (NPA) were obtained during the study\nperiod from patients who underwent antigen detection RSV, adenovirus, parainfluenza\nand influenza A and B by immunofluorescence (IF). Detection of influenza A and B was\nalso carried out through real time RT-PCR. For a representative proportion of NPAs\nwho were negative by IF (452 samples) HRV was determined through RT-PCR,\ndetecting the virus genome in 172. This resulted in a 38.1% positivity and a second place (8.5%) in the rate of respiratory virus flow. It was found in all months of the year,\npredominantly during March 2010 and from August to February 2011.\n60% of hospitalized children with HRV attributable to ARI were under 6 months,\nwith a median age of 4 months. Age proved not to be a risk factor for developing\nsevere disease. The proportion of infected children was similar for both genders.\nClinical and epidemiological aspects of 145 patients were analyzed. 31% had a\nmedical history, including prematurity (55.6 %) and recurrent wheezing (51.1%) as\nprevailing conditions. The most common discharge diagnoses were pneumonia\n(35.2%), bronchiolitis (32.4%) and bronchitis (12.4%). The aerial radiological findings\nobserved include (75.2%) trapping interstitial infiltrate (67.9 %) and alveolar infiltrates\n(35.8%). 72.7% of patients had leukocytosis. Antibiotics were used in 66.4 % of\ntreatments and 85.5% of the children required oxygen supply during hospitalization.\nThe median duration of hospital stay was 6 days and 15.9 % of patients required\nadmission to intensive care unit (ICU). No significant differences were observed\nbetween the age of ICU patients and that of patients who did not have severe clinical\nsymptoms. Similarly, having a clinical history did not prove a risk factor for developing\nsevere disease.\nThis study showed that HRVs are associated with ARI-induced children\nhospitalizations. The implementation of an RT-PCR endpoint technique could quickly\ndetect, with sensitivity and specificity, a virus that is the second in importance with\ngreatest circulation (after VSR), and will be capable of routinely reducing ARI cases of\nunknown origin, thus establishing the role these viruses play in our environment and\nfacilitating the choice of appropriate therapeutic approaches.Fil: Rudi, Juan Manuel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; ArgentinaLas infecciones respiratorias agudas (IRA), cuyas patologías más frecuentes son la\nneumonía, la bronquiolitis y la enfermedad tipo influenza, afectan a toda la población,\npero principalmente a los menores de 5 años y mayores de 65 años, encontrándose\nentre las primeras causas de mortalidad a nivel mundial. En Argentina, son la principal\ncausa de consulta e internación en todas las edades, y en Santa Fe, representaron casi\nel 20% de las internaciones registradas en el hospital pediátrico de referencia de la\nciudad durante el año 2010. Los patógenos virales más frecuentes causantes de IRA\nson el virus sincicial respiratorio (VSR), influenza, parainfluenza, adenovirus,\nmetapneumovirus, coronavirus y rinovirus.\nLos rinovirus humanos (HRV) pertenecen a la familia Picornaviridae. Son virus\nesféricos no envueltos y su genoma es una única molécula lineal de ARN de sentido\npositivo, que se encuentra recubierta por una cápside de simetría icosaédrica. Aislados\npor primera vez en 1956, en la actualidad se conocen más de 100 serotipos diferentes\nque se encuentran agrupados en tres especies, HRVA, HRVB y HRVC. Son\ntermoestables y se diseminan a través de las secreciones respiratorias contaminadas\nmediante el contacto directo entre personas. Es posible hallarlos en personas de todas\nlas edades, su diseminación es a nivel mundial y, aunque la frecuencia de circulación\nsuele ser mayor en los meses de otoño y primavera, pueden detectarse en todos los\nmeses del año. Si bien históricamente los HRV fueron considerados patógenos de las\nvías aéreas superiores, en la actualidad se ha demostrado que también ocasionan\ninfecciones en el tracto respiratorio inferior, causando hospitalizaciones de niños con\nneumonía, bronquiolitis y obstrucciones pulmonares crónicas. También se encuentran\nasociados a pacientes que presentan episodios de sibilancias recurrentes,\nexacerbaciones de asma, bronquitis, sinusitis y otitis media aguda.\nEl diagnóstico virológico es necesario para determinar la etiología de las IRAs, ya\nque los cuadros clínicos producidos por los distintos virus suelen ser similares. Además,\npermite restringir el uso innecesario de antibióticos. El aislamiento viral en cultivo de\ntejido seguido por el test de labilidad ácida representa el método estándar en el\nlaboratorio para la confirmación de una infección por HRV, pero el tiempo requerido\nes superior a dos semanas, lo que es de valor limitado para una decisión terapéutica.\nLas técnicas basadas en la detección de ácidos nucleicos por reacción en cadena de la\npolimerasa (PCR) han permitido incrementar la identificación de este virus.\nEl hecho de que en Santa Fe no se hayan efectuado hasta el momento estudios\nrelacionados a los HRV motivó la realización de este trabajo, que se propuso\nseleccionar y optimizar una técnica de PCR que permitiera la detección del virus en\npacientes pediátricos hospitalizados con IRA durante el período marzo 2010-febrero\n2011, para luego estudiar su frecuencia, estacionalidad y epidemiología, como así\ntambién aspectos clínicos-epidemiológicos de los pacientes infectados.\nPara el desarrollo del estudio, se seleccionó una RT-PCR anidada, altamente\nsensible y específica, que fue testeada por Steininger et al. (2001) para la mayoría de\nlos serotipos de HRV conocidos y que amplifica un fragmento altamente conservado\ndel genoma viral. Se optimizó la técnica con controles de positivos del virus, variando\nparámetros críticos del ensayo, y se corroboró la especificidad de la misma al ensayar\ncontroles positivos de otros virus respiratorios.\nSe obtuvieron un total de 2020 aspirados nasofaríngeos (ANF) de pacientes\ndurante el período estudiado, a los cuales se les realizó la detección de antígenos VSR,\nadenovirus, parainfluenza e influenza A y B por inmunofluorescencia (IF). La detección\nde influenza A y B se realizó además por RT-PCR real time. A un porcentaje\nrepresentativo de ANF que resultaron negativos por IF (452 muestras) se les realizó la\ndeterminación de HRV mediante RT-PCR, detectando el genoma del virus en 172, lo\nque representó una positividad del 38,1% y un segundo lugar (8,5%) en la frecuencia\nde circulación de virus respiratorios. Se encontró en todos los meses del año,\npredominando durante marzo de 2010 y desde agosto hasta febrero de 2011.\nEl 60% de los niños hospitalizados con IRA atribuibles a HRV fueron menores de 6\nmeses, siendo la mediana de la edad de 4 meses. Se comprobó que la edad no fue un\nfactor de riesgo para desarrollar enfermedad grave. La proporción de infectados fue\nsimilar para ambos géneros.\nSe analizaron aspectos clínicos y epidemiológicos de 145 pacientes. El 31%\npresentó antecedentes clínicos, entre los que se destacaron la prematurez (55,6%) y\nlas sibilancias recurrentes (51,1%). Los diagnósticos de egreso más frecuentes fueron la\nneumonía (35,2%), la bronquiolitis (32,4%) y la bronquitis (12,4%). Como hallazgos\nradiológicos se observó atrapamiento aéreo (75,2%), infiltrado instersticial (67,9%) e\ninfiltrado alveolar (35,8%). El 72,7% de los pacientes presentó leucocitosis. Se\nutilizaron antibióticos en el 66,4% de los tratamientos y el 85,5% de los niños requirió\nsuministro de oxígeno durante la internación. La mediana de la duración de la estadía\nhospitalaria fue de 6 días y el 15,9% de los pacientes requirió internación en unidad de\nterapia intensiva (UTI). No se observaron diferencias significativas entre las edades de\nlos pacientes internados en UTI y las de aquellos que no presentaron un cuadro clínico\nde gravedad, como así tampoco el presentar un antecedente clínico fue un factor de\nriesgo para desarrollar enfermedad severa.\nEl presente estudio evidenció que los HRV están asociados a hospitalizaciones de\nniños por IRA. La implementación de una técnica de RT-PCR de punto final logró\ndetectar con rapidez, sensibilidad y especificidad un virus que se ubicó en el segundo\nlugar de circulación (luego del VSR), y permitirá, en forma rutinaria, disminuir los casos\nde IRA de origen desconocido, estableciendo el papel que desempeñan estos virus en\nnuestro medio y facilitando la elección de conductas terapéuticas apropiadas
