Validierung eines Protokolls zur manuellen, mutationsspezifischen BRAF V600E Immunhistochemie

Abstract

BRAF ist die B-Isoform der RAF Kinase, welche Teil des MAP-Kinase-Signalwegs ist und die Zellproliferation reguliert. Sie ist als Protoonkogen anfällig für Mutationen, die zur Entstehung von Malignomen führen können. Über 95% der Mutationen des BRAF Gens macht die BRAF V600E Mutation aus. Sie lässt sich in verschiedensten humanen Krebsarten nachweisen und ist eine der häufigsten Mutationen in Malig-nem Melanom (44%), papillärem Schilddrüsenkarzinom (52%) und Klassischer Haarzellleukämie (100%). Wird sie nachgewiesen, muss man davon ausgehen, dass sie teil- oder möglicherweise sogar hauptverantwortlich für die Entstehung des Malignoms ist, und eine zielgerichtete Therapie (targeted therapy) mit einem Inhi-bitor gegen das mutierte Protein ist zu erwägen. Häufig stoppt eine solche Behand-lung den Tumorprogress und es gibt eindeutige Evidenz, dass dadurch die Mittlere, sowie die Gesamtüberlebensrate signifikant erhöht werden können. Im Focus der Diskussion um die geeignete BRAF Diagnostik steht neben sequenzanalytischen Verfahren auch der Mutationsnachweis auf Zellebene mittels Immunhistochemie. In der hier vorgelegten Arbeit wurde erstmals gezeigt, wie man BRAF V600E manuell mittels Immunhistochemie nachweisen kann, und es wurde anhand einer Kohorte aus 33 Fällen erörtert, wie sensitiv und spezifisch dieses Verfahren im Vergleich zu bereits etablierten immunhistochemischen Protokollen abeitet, die allerdings nur für automatisierte Färbesysteme publiziert sind. Ferner wurde die Methode mit Pyrose-quenzergebnissen der Kohorte verglichen, die aus der Klinikroutine der Uniklinik Ulm stammen. Die empirische Protokollentwicklung ergab, dass sich der diagnosti-sche BRAF V600E spezifische Antikörper am besten nach einer hitzeinduzierten Epitopdemaskierung in EDTA Puffer pH 8,0 im Dampfgarer und einer Detektion mit-tels Peroxidase sichtbar machen lässt. Dies gelingt auch bei formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Proben, die zuvor dekalzifiziert wurden. Zur Primärantikör-perinkubation sind Verdünnungen bis 1:100 möglich, ohne Verluste bei der Fär-bungsintensität hinnehmen zu müssen. In der anschließenden Validierung des Pro-tokolls mittels Kohortenstudie zeigte sich, dass sowohl die manuelle, als auch die in Heidelberg von der Arbeitsgruppe des Erstbeschreibers des Antikörpers durchge-führte automatisierte Färbung insgesamt mit 95%iger Sensitivität und 100%iger Spezifität sehr gut funktionierten, jedoch pro Methode einen mutierten Fall nicht kor-rekt klassifizieren konnten. Interessanterweise konnte aber auch die Pyrosequen-zierung in einem Fall keine Aussage zum Mutationsstatus der Probe machen und erreichte somit auch nur eine Sensitivität von 95% in der Studienkohorte. Da jede der Methoden einen anderen mutierten Fall nicht erkannt hat, und vor dem Hinter-grund der klinischen Relevanz einer möglichst sensitiven Diagnostik der Mutation, lautet die Schlussfolgerung dieser Arbeit, dass beide Verfahren (Immunhistochemie und Pyrosequenzierung) sequentiell und sich gegenseitig ergänzend eingesetzt werden sollten. Trotz guter Ergebnisse bei der BRAF V600E Detektion, muss man allerdings die Limitation der Immunhistochemie auf die V600E Mutation berücksich-tigen. Der zwar insgesamt geringe Anteil von unter 5% bzw. je nach Malignom auch bis zu 10% (Malignes Melanom) betragende Anteil anderer BRAF Mutationen als V600E, beispielsweise V600K, konnte mit dem hier verwendeten Antikörper nicht detektiert werden. Obwohl Fälle beschrieben sind, in denen eine Färbung anders mutierter BRAF Proteine auch mit dem V600E spezifischen Antikörper gelungen ist, können diese Mutationen, wie auch in dieser Studie, in der Regel nur mittels Se-quenzanalyse nachgewiesen werden. Und da Malignompatienten mit anderen BRAF Mutationen als V600E ebenfalls von den Inhibitoren Vemurafenib und Da-brafenib profitieren können, bleibt für die sichere Identifikation in diesen seltenen Fällen bisher nur die Sequenzanalyse übrig