Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica
Abstract
The non neuronal cholinergic system (nNCS) is constituted by acetylcholine (ACh), choline acetyl transferase and\nacetylcholinesterase, the enzymes that synthesize and degrade ACh, and nicotinic and muscarinic receptors\n(mAChR), all of them expressed in cells with non nervous origin. The nNCS has been implicated in the regulation\nof cellular physiological and pathological functions. Regarding the latter, previous works reported the\nparticipation of nNCS in tumor progression. Particularly, mAChR are over-expressed in a great number of\ntumors. We demonstrated the expression of these receptors in MCF-7 cells, derived from a human mammary\nadenocarcinoma, as well as in murine mammary tumor, cells and their absence in the non tumorigenic cell line,\nMCF-10A. Furthermore, we observed that the activation of mAChR stimulates cell proliferation and migration in\nvitro and the angiogenic response in vivo.\nTaking into account these previous results, we set out to investigate whether the expression of the subtypes 3\nand 4 of mAChR in MCF-10A cells promotes the malignization of these cells. For this aim, we generated three\ncell lines by transfection, which expressed the subtypes 3 and 4 of mAChR denominated: MCF-10A-M3, MCF-\n10A-M4 and MCF-10A-M3M4. In these three cell lines, we studied the effect of cholinergic activation on cell\ncycle, and cell migration in vitro, as well as neovascularization and tumor growth in vivo. We used the MCF-7 cell\nline as positive control. We demonstrated that all cell lines transfected express mRNA and proteins for the\nsubtypes 3 and/or 4 of mAChR. We observed that the cholinergic agonist carbachol increased the percentage of\ncells in S/G2/M phase in MCF-10A-M3, MCF-10A-M4 and MCF-10A-M3M4 cells, and that this effect was reduced\nby atropine, a muscarinic non-selective antagonist.\nWe also studied the effect of the agonist on cell migration and metalloproteinase-9 (MMP-9) expression, as\nfundamental parameters in tumor invasion. The treatment with carbachol increased migration and MMP-9\nexpression in all transfected cell lines, in a similar manner to that observed in MCF-7 cells, while it had no effect\nover these parameters in MCF-10A cells. The action of carbachol was reduced by atropine and also by 4-DAMP\nor tropicamide, selective antagonists for M3 and M4 receptors, respectively.\nAngiogenesis is a central step for tumor progression and for this reason, we studied the ability of MCF-10A-M3,\nMCF-10A-M4 and MCF-10A-M3M4 cells to generate new blood vessels in vivo. We found that cells increased\nneovascularization similarly to MCF-7 cells. Also, the transfected cell lines expressed de novo vascular\nendothelial growth factor-A (VEGF-A), a constitutive property in MCF-7 cells.\nFinally we evaluated tumorigenic ability in vivo and we found that MCF-10A-M3, MCF-10A-M4 and MCF-10AM3M4\ncells generate tumors in NUDE mice, while MCF-10A cells lack of this ability.\nIn conclusion, the expression of one or more subtypes of mAChR in mammary human non-tumorigenic cells is\nenough to increase cell proliferation, migration and MMP-9 production in vitro, and to acquire the ability to\ninduce neovascularization, to produce VEGF and to generate tumors in vivo.Fil: Martinez Pulido, Paola. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; ArgentinaEl sistema colinérgico no neuronal (SCnN) está conformado por la acetilcolina, la enzima que la\nsintetiza, la colina acetil transferasa, la enzima que la degrada, la acetilcolinesterasa y los receptores\nnicotínicos y muscarínicos (M) presentes en células de origen no nervioso. Este sistema participa en la\nregulación de funciones celulares fisiológicas y patológicas. En este sentido se ha reportado la\nparticipación del SCnN en la progresión tumoral. En particular, la sobreexpresión de los receptores M\nse ha descripto en un gran número de tumores. Hemos demostrado la expresión de estos receptores\nen células de la línea MCF-7, derivadas de un adenocarcinoma mamario humano, así como también en\ncélulas tumorales mamarias murinas y la ausencia de expresión en células no tumorigénicas mamarias\nhumanas como las de la línea MCF-10A. Además observamos que la activación de los receptores M\naumenta la proliferación, la migración celular y la angiogénesis in vivo.\nSobre la base de estos antecedentes nos propusimos evaluar si la expresión de los subtipos 3 y 4 de los\nreceptores M en las células MCF-10A promueve la transformación celular hacia un fenotipo tumoral.\nPara esto generamos por transfección tres líneas celulares que expresan los subtipos 3 y/o 4 de los\nreceptores M, que denominamos: MCF-10A-M3, MCF-10A-M4 y MCF-10A-M3M4. En estas tres líneas\nestudiamos el efecto de la activación colinérgica sobre el ciclo celular, la migración celular, la respuesta\nangiogénica y el crecimiento tumoral in vivo, utilizando a las células MCF-7 como control positivo.\nDemostramos que las tres líneas celulares generadas expresan el transcripto y las proteínas para los\nsubtipos 3 y 4 de receptores M. Observamos que el tratamiento con el agonista carbacol incrementó el\nporcentaje de células en fase S/G2/M en las células MCF-10A-M3, MCF-10A-M4 y MCF-10A-M3M4 con\nrespecto al control y que el efecto estimulante del carbacol se revierte en presencia del antagonista no\nselectivo atropina.\nTambién estudiamos el efecto del agonista en la migración celular y en la expresión de la\nmetaloproteinasa-9 (MMP-9), como parámetros fundamentales en la invasión tumoral. Demostramos\nque el tratamiento con carbacol incrementó la capacidad migratoria y la expresión de MMP-9 en las\ncélulas MCF-10A-M3, MCF-10A-M4 y MCF-10A-M3M4 de manera comparable a lo observado en las\ncélulas tumorales MCF-7, mientras que no tuvo efecto sobre estos parámetros en las células MCF-10A.\nEstos efectos se redujeron en presencia de atropina así como de los antagonistas selectivos de los\nsubtipos M3 y M4, 4-DAMP y tropicamida respectivamente.\nLa angiogénesis es un paso central en la progresión tumoral. Estudiamos la capacidad de las células\nMCF-10A-M3, MCF-10A-M4 y MCF-10A-M3M4 para generar nuevos vasos sanguíneos in vivo.\nEncontramos que estas células aumentan la neovascularización de manera semejante a las células\nMCF-7. Además, las células transfectadas adquirieron la capacidad de sintetizar el principal promotor\nde la angiogénesis que es el factor de crecimiento del endotelio vascular-A (VEGF-A), una propiedad\nconstitutiva en las células MCF-7.\nPor ultimo evaluamos la capacidad tumorigénica in vivo y encontramos que las células MCF-10A-M3,\nMCF-10A-M4 y MCF-10A-M3M4, forman tumores en ratones NUDE mientras que las células MCF-10A\ncarecen de esta capacidad.\nConcluimos que la expresión de uno o más subtipos de los receptores M en células de mama humana\nno tumorigénicas es suficiente para aumentar la proliferación, la migración e indujo la producción de\nMMP-9 in vitro y adquirir de novo la capacidad de inducir neovascularización, sintetizar VEGF-A y\nformar tumores in vivo
