Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica
Abstract
Fil: Mansini, Adrián Pablo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, ArgentinaLas leucemias agudas de infantes (niños menores de 1 año) (LAI) constituyen una entidad única, con características biológicas y clínicas particulares que requieren de un tratamiento individualizado. Presentan frecuentemente alteraciones genéticas que involucran al gen MLL, cuya presencia las define como un grupo de pobre pronóstico. Las alteraciones en MLL pueden ser estudiadas mediante bandeo G, hibridación in situ con fluorescencia (FISH), transcripción reversa seguida de reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) o PCR inversa de larga distancia (LDI-PCR), entre otras. Cada técnica posee ventajas y desventajas, siendo complementarias para la correcta caracterización de dichas alteraciones. Además, la evaluación de la respuesta al tratamiento incluye la determinación de la enfermedad mínima residual (EMR) mediante técnicas altamente sensibles como la citometría de flujo y PCR en tiempo real (RQ-PCR), que utiliza secuencias ?blanco? específicas del clon leucémico. En la leucemia linfoblástica aguda (LLA) se utiliza como blanco las secuencias V-(D)-J de los rearreglos de los genes de Ig/TCR. Sin embargo, su utilidad es limitada en los infantes, ya que muchas de ellas no presentan rearreglos. La alta incidencia de rearreglos de MLL que presentan las LAI, permite utilizar como blanco para cuantificar la EMR la secuencia de fusión del rearreglo a nivel genómico, caracterizada por LDI-PCR. El principal objetivo de este trabajo de tesis fue desarrollar una minuciosa caracterización molecular de las LAI, incluyendo el estudio por LDI-PCR, para incorporar una nueva herramienta diagnóstica. La puesta a punto e implementación de la LDI-PCR permitió identificar blancos moleculares para la determinación de la EMR. Permitió además detectar un nuevo compañero de fusión de MLL nunca antes descripto, y poner a punto la detección Resumen 176 mediante RT-PCR de nuevos rearreglos, ampliando el screening empleado en el laboratorio para el diagnóstico de LA. En cuanto a la determinación de EMR utilizando los rearreglos de MLL se observó la necesidad de emplear sondas marcadas como sistema de detección, debido a dificultades para lograr especificidad y adecuado rango cuantitativo mediante el empleo de SYBR Green relacionadas con las características de las secuencias involucradas. Uno resultados más importantes y prometedor de este trabajo de tesis es que se estableció que las secuencias de fusión de ADN específicas de cada paciente pueden ser utilizadas como blanco molecular para seguimiento de la EMR por técnicas de PCR cuantitativas. Los alelos de fusión génica son marcadores más confiables para los estudios de EMR que los rearreglos de Ig/TCR, debido a su estabilildad clonal. Se obtuvieron datos positivos para el diagnóstico de alteraciones del gen MLL en 34 pacientes con LA, a través del estudio de LDI-PCR. En todos ellos se identificó y caracterizó por secuenciación al menos un alelo de fusión de MLL. Este es el primer estudio realizado en Argentina, en una institución pública estableciendo que el uso de estos marcadores para la determinación de EMR contribuirá a la mejor estratificación, mejor adecuación del tratamiento y resultados de los pacientes infantes con leucemia aguda. También se describen 3 nuevos casos infrecuentes de leucemia linfoblástica B madura con morfología FAB L1 o L2 y que corresponden a infantes con rearreglos del gen MLL. Teniendo en cuenta los malos resultados obtenidos en conjunto, se podría especular que este grupo de pacientes necesita un esquema de quimioterapia diferente al actual. Los datos aportados en esta tesis pueden contribuir a plantear nuevos esquemas quimioterápicos más eficaces. Resumen 177 Adicionalmente, se analizaron las mutaciones del gen FLT3 en LAI y se demostró que el 15% del total de pacientes estudiados presentó mutaciones del tipo TKD. Este resultado sugiere que es conveniente estudiar estas mutaciones en todos los pacientes infantes con LA a fin de identificar a aquellos pacientes que responderían a la terapia con nuevas drogas inhibidoras de FLT3. Con respecto al estudio de las mutaciones en GATA-1 en infantes con Síndrome de Down (SD) y mielopoyesis anormal transitoria (MAT) y/o leucemia megacarioblástica aguda (LMCA), se detectaron mutaciones en GATA-1 en todos los pacientes analizados. Uno de los pacientes con diagnóstico de MAT remitió espontáneamente y 9 meses más tarde desarrolló LMCA. Se detectó la existencia de la misma mutación en GATA-1 en ambas muestras (MAT y LMCA), el análisis citogenético mostró la adquisición de nuevas anomalías por parte del clon leucémico. Estos hallazgos fortalecen la teoría de que ambos cuadros involucran a la misma población de células hematopoyéticas y sugiere que la evolución de MAT a LMCA sería consecuencia de la adquisición de mutaciones adicionales. Este estudio de las mutaciones del gen GATA-1, es el primer estudio realizado en la Argentina, en el que se caracterizaron estas mutaciones en pacientes con SD y MAT y/o LMCA. La alta frecuencia de mutaciones detectada sugeriría la conveniencia de investigar su presencia en todos los neonatos con SD a fin de individualizar a aquellos con mayor riesgo de presentar MAT y/o LMCA, quienes deberían recibir un control clínico más riguroso, con la finalidad de realizar un diagnóstico precoz que evite las complicaciones del cuadro agudo. Además, la evaluación seriada de las mutaciones detectadas permitiría monitorear a los pacientes con MAT para comprobar la cinética de desaparición del clon preleucémico y/o predecir tempranamente una eventual progresión a LMCA. Resumen 178 Finalmente, este trabajo de tesis tiene su foco en las alteraciones moleculares de los infantes, tanto las anormalidades del gen MLL, FLT3 y mutaciones de GATA-1, con la finalidad de lograr un mejor conocimiento de esta población de pacientes y desarrollar las técnicas necesarias para su estudio
