Desenvolvimento de plataformas nanométricas híbridas baseadas em polímero/enzima visando aplicações em biossensores

Abstract

Foodborne illness cases are common in Brazil and in the world. However, in many cases the microorganism causing the illness cannot properly identified. In addition, traditional analyses usually employed for identifying such microorganisms are often expensive and time consuming. In this context, the development of novel methods capable of detecting such microorganism in a fast way, similarly to a pre-selection method to indicate the positive or negative presence of pathogenic, are highly pursued. In this work, two systems using a concept of Electronic Tongue were developed. The first system used the Layer-by-Layer (LbL) technique to immobilize lysozyme, trypsin and pepsin enzymes in nanostructured films. In the second system, the immobilization process was combined using the LbL technique and covalent bonding for lysozyme and trypsin enzymes. The trypsin and pepsin can react with bacterial sub-products released in the medium, while the lysozyme can react directly with the gram-positive bacteria cell wall. All parameters required to obtain stable films with preserved enzymatic activity were investigated and determined. In the first case, the detection of Escherichia coli using the Electrical Impedance Spectroscopy yielded detection of bacteria at 105 UFC (intermediate values). The second electronic tongue was composed by sensing units formed by lysozyme and trypsin immobilized by covalent and electrostatic (LbL) bonds, allowing the reaction with either by products or with the bacterial cell wall. Contamined solutions with the Gram-positive Staphylococcus aureus, Gram-negative Salmonella bacteria and a mixed solution with both were analyzed. The second system was able to detect small bacteria concentrations at 103 CFU. Finally, the solution re-suspension treatment showed to be beneficial for improving the detection results. The electronic tongue was capable of distinguishing solutions contaminated with bacteria, showing potential to aid in the prevention of foodbourne diseases.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA)Casos de intoxicação de origem alimentar causados por microrganismos são comuns no Brasil e no mundo. Contudo, em muitos dos surtos não se consegue identificar qual é o microrganismo causador da contaminação. Além disto, as análises tradicionais usualmente empregadas para identificação do microrganismo são muitas vezes caras e demoradas. Deste modo, o desenvolvimento de métodos para uma rápida detecção de microrganismos, similar a um sistema de triagem, focado em indicar se há ou não a contaminação por patogênicos antes da realização de testes específicos, são de grande interesse. Neste trabalho foram desenvolvidos dois sistemas utilizando o conceito de Língua Eletrônica. No primeiro sistema utilizou-se a técnica de Layer-by-Layer (LbL) para o crescimento de filmes nanoestruturados juntamente com a imobilização das enzimas lisozima, tripsina e pepsina. As enzimas tripsina e pepsina têm como característica reagirem com subprodutos da presença de bactérias no meio, enquanto a enzima lisozima reage diretamente com a parede celular das bactérias Gram-positivas. Foram estudados e definidos todos os parâmetros necessários para a formação de filmes estáveis mantendo as enzimas em sua forma ativa. No primeiro sistema foi avaliada a detecção de Escherichia coli utilizando a técnica de Espectroscopia de Impedância Elétrica, obtendo resultados satisfatórios na detecção das bactérias em valores intermediários de 105 UFC. O segundo sistema de língua eletrônica foi composto por unidades sensoriais com as enzimas lisozima e tripsina imobilizadas por meio de ligações covalentes e eletrostáticas (LbL), podendo ocorrer reações tanto com subprodutos da presença bacteriana quanto diretamente com a parede celular das bactérias. Foram analisadas soluções contaminadas com as bactérias Gram-positivas Staphylococcus aureus, Gram-negativas Salmonella e também a mistura de ambas, sendo possível distinguir baixas concentrações das mesmas e na ordem de 103 UFC. Por ultimo, verificou-se que o tratamento das soluções por meio da re-suspensão das bactérias influenciou positivamente nos resultados de detecção, suprimindo a influência da presença do meio de cultura nas repostas obtidas. A Língua Eletrônica apresentada foi capaz de distinguir soluções contaminadas com bactérias, tendo potencial para auxiliar na prevenção de surtos de doenças transmitida por alimento