Análise metagenômica da comunidade bacteriana de vacas com distúrbios reprodutivos.

Abstract

Sendo animais economicamente explorados, patologias que afetam o gado tem uma conseqüência direta sobre a produção, levando a uma diminuição dos lucros. Micoplasmoses são fontes de diversos distúrbios reprodutivos que atingem o gado, como agalactia contagiosa, mastite, endometrite, placentite, aborto, infertilidade e vulvovaginite granular. O tratamento destas patologias pode ser muito desafiadora, impulsionando este estudo a compreender a dinâmica das comunidades bacterianas envolvidas na instalação da infecção e no desenvolvimento dos sintomas. Com este fim, amostras do trato genital de vacas saudáveis e vacas com sintomas de micoplasmose foram coletadas usando swabs. O material genético foi purificado e extraído dessas amostras e, após a amplificação do gene 16s, o seqüenciamento foi realizado pela plataforma de seqüenciamento Ion Torrent Personal Genome Machine - PGM, usando reagentes do kit 200 (Life Technologies). Os resultados do seqüenciamento foram submetidos a programas de bioinformática para desenvolvimento e análise dos perfis microbianos comparativos. Os resultados mostram que em vacas saudáveis as bactérias colonizando o trato genital são em sua totalidade associadas ao hospedeiro e não patogênicas. A maioria era anaeróbia, apresentando um pH neutro como ótimo para crescimento bacteriano. Os dados da diversidade bacteriana do perfil com distúrbios reprodutivos sugerem uma mudança significativa no ambiente. Neste estado, bactérias anaeróbias, aeróbias e com requerimento de oxigênio facultativo estão presentes. O pH do trato genital de vacas doentes é mais ácido e a presença de oxigênio é um fator importante, indicando uma mudança ecológica na comunidade bacteriana. A quantidade total e a diversidade de gêneros bacterianos é maior nos indivíduos que apresentam os sintomas. Isto novamente sugere uma mudança ambiental, permitindo a colonização dos nichos presentes no trato genital por novas bactérias. A relação entre bactérias patogênicas aeróbias e anaeróbias nos indivíduos doentes pode representar um caso de sinergia bacteriana, em que diferentes bactérias trabalham em conjunto no desenvolvimento da infecção, uma condição observada em diversos modelos animais. Enterobacteriaceae e Bacteroides são os grupos mais numerosos presentes em ambos os estados. Enterobacteriaceae é conhecido por diminuir o pH local, inibindo a função dos neutrófilos através da produção de sucinato, enquanto Bacteroides dificulta a fagocitose através da competição com opsoninas. Isto diminui a opsonização de bactérias patogênicas, prejudicando a resposta imunológica a infecção. No perfil com distúrbios reprodutivos novas famílias emergem, como Pasteurellaceae, cujas espécie Histophilus somni é um conhecido patógeno oportunista de gato causando doenças nos sistemas respiratório, genital, nervoso e circulatório. Arcanobacterium pyogenes, outra espécie patogênica com relações ecológicas bem estudadas, Prevotella, Fusobacterium e Mycoplasma também estão presentes, agravando a infecção. Nossos dados sugerem que os sintomas não são resultantes da ação de um único patógeno e sim um reflexo de uma mudança ambiental favorável a colonização por diferentes bactérias patogênicas que trabalham em conjunto para causar a doença.Pathologies in cattle have a direct impact on production, leading to a profit decrease. Mycoplasmosis causes a range of reproductive disorders, such as contagious agalactia, mastitis, endometritis, placentitis, abortion, infertility and granular vulvovaginitis. The treatment of these pathologies can be specially challenging, driving this study to comprehend the dynamic of the bacterial communities involved in the instauration of the infection and symptoms development. To do so, samples of the genital tract from healthy cows and cows with symptoms of mycoplasmosis were collected using swabs. The genetic material was purified and extracted from these samples and, following amplification of the 16S RNA gene, sequencing of amplicon libraries was performed by the Ion Torrent Personal Genome Machine - PGM sequencing platform, using Sequencing kit 200 (Life Technologies) reagents. The sequencing results were submitted to bioinformatics programs for the development and analysis of the comparative microbial profiles. Our results show that in healthy cows the bacteria colonizing the genital tract were in totality host associated and non-pathogenic. The majority were anaerobic with a neutral pH optimal for bacterial growth. The data for the bacterial diversity in the profile with reproductive disorders suggests a significant change in the environment. In this state, anaerobic, facultative and aerobic genera are present. The pH of the genital tract of cows affected by the reproductive disorders is more acid and the presence of oxygen is an important factor, indicating an interesting shift in the ecology of the bacterial community. The total quantity and diversity of bacterial genera are higher in the affected individuals. This suggests an environmental change taking place, permitting new bacteria to colonize the genital tract niches. The relationship between anaerobic and aerobic pathogenic bacteria in the affected animals may be a case of bacterial synergy, in which different bacteria work together in the development of the infection, a condition observed in distinct animal models. Enterobacteriaceae and Bacteroides are the most numerous groups present in both the healthy and the affected states. Enterobacteriaceae are known for decreasing local pH, inhibiting neutrophil functions via succinate production, while Bacteroides difficult phagocytosis through competition with opsonins. This reduces bacteria opsonisation, hindering the immune response to infection. In the profile with reproductive disorders new families emerge, such as Pasteurellaceae, which species Histophilus somni is a known opportunistic cattle pathogen causing diseases in the respiratory, genital, nervous and circulatory systems. Arcanobacterium pyogenes, another pathogenic species with well studied ecologic relationships, Prevotella, Fusobacterium and Mycoplasma are also present, aggravating the infection. Our data suggests that the symptoms are not a result of a single pathogen, but rather a reflection of an environmental change favourable to colonization by different pathogenic bacteria that work together to cause disease

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