Conformational and functional characterization of AAA domain proteins through the investigation of human ANKCLP and Rvbs from Leishmania major and Saccharomyces cerevisiae
Orientador: Carlos Henrique Inacio RamosTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A família de proteínas AAA+ são enzimas ATPases associadas a inúmeras atividades celulares. Caracterizadas principalmente pela presença do domínio de ligação e hidrólise de nucleotídeos, conhecido como NBD (Nucleotide Binding Domain), as proteínas AAA+ possuem funções que compreendem desde a replicação do DNA até a degradação de proteínas. Dessa forma, esta tese descreve os resultados obtidos com algumas proteínas com domínio AAA+: ANKCLP humana e as Rvbs 1 e 2 de Leishmania major. A proteína ANKCLP humana possui um domínio de ligação e hidrólise de ATP, que é semelhante às chaperonas desagregases de outros organismos. Com isso, utilizando o modelo de estudo em leveduras, nossos resultados mostraram que a proteína ANKCLP humana não auxiliou na sobrevivência em células com o gene deletado da Hsp104, chaperona desagregase bem caracterizada em leveduras. Além disso, a ANKCLP não foi capaz de remodelar os agregados amilóides nas células de leveduras que continham fatores para formação de príons. Devido a semelhança com a ANKCLP, nos interessamos pelas características da proteína Hsp78, chaperona desagregase de mitocôndria de leveduras. Sendo assim, produzimos uma mini-revisão de literatura sobre esta proteína e uma visão crítica sobre a proteína ANKCLP ser uma chaperona desagregase em animais. Também neste trabalho foram estudadas as proteínas Rvbs que também possuem um domínio NBD e foram pela primeira vez descritas no organismo Leishmania major, causador da leishmaniose em mamíferos. De fato, estas helicases apesar de serem bem conhecidas em leveduras e humanos, são bem menos estudadas quando se trata de protozoários. Com isso, a Rvb1 e Rvb2 de L. major foram purificadas com sucesso, sendo que a LmRvb1 foi capaz de formar um pentâmero em solução, mas não possui atividade ATPásica in vitro. Já a LmRvb2 forma um grande oligômero e possui atividade ATPásica in vitro. A co-expressão destas proteínas demonstrou a presença de pelo menos um dímero em solução. Experimentos de estabilidade e fluorescência indicaram que estas proteínas interagem nestas condições e este dímero possui atividade ATPásica in vitro, assim como a LmRvb2. Por fim, com este trabalho foi possível compreender parte da função e conformação de algumas proteínas da família AAA+ e esperamos contribuir para o maior entendimento destas proteínas nos diferentes organismosAbstract: AAA+ proteins family are ATPase enzymes associated with diverse cellular activities. Mainly characterized by the presence of the nucleotide binding domain, known as NBD (Nucleotide Binding Domain), the AAA proteins can act of a ranging of functions from DNA replication to protein degradation. Thus, this thesis describes the results obtained with some AAA+ proteins: human ANKCLP and Rvbs 1 and 2 from Leishmania major. The human ANKCLP protein has a NBD domain which is very similar to the NBD domais from chaperone disaggregases. Therefore, using the yeast model, we showed that the ANKCLP protein didn¿t complement the yeast cell survival in the absence of Hsp104, chaperone disaggregate with two AAA+ domains and well characterized in yeast. In addition, the ANKCLP was not able to remodel amyloid aggregates in yeast cells which contain prion formation factors. Due to the similarity with ANKCLP, we were interested in the characteristics of the Hsp78 protein, chaperone disaggregate from yeast mitochondria. Thus, we have produced a mini-review on this protein and a critical view about the ANKCLP protein as a hypothetical chaperone disaggregase in animals. Also, is this work we studied the proteins Rvbs which also have one NBD domain and, in the first time, they have been described from Leishmania major, which causes leishmaniasis in mammals. Indeed, although these proteins are well described from human and yeast, they are not well studied when it comes from protozoa. Therefore, the Rvb1 and Rvb2 were successfully purified, and LmRvb1 was able to form a pentamer in solution, but did not have ATPase activity in vitro. LmRvb2 forms a large oligomer and has ATPase activity in vitro. The co-expression of Rvb1 and Rvb2 formed at least a dimer in solution. Stability and fluorescence experiments indicated that these proteins interact under these conditions and this dimer has ATPase activity in vitro, as well as an LmRvb2. Finally, with this work we hope to contribute to greater understanding of these AAA+ proteinsDoutoradoBioquimicaDoutora em Biologia Funcional e Molecular2013/10939-2FAPES
