Evaluation of clinical and environmental of Aspergillus spp. isolates : morphological and molecular identification; susceptibility profile and search for azoles resistance related mutations
Orientador: Angélica Zaninelli SchreiberTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: Membros do gênero Aspergillus são patógenos fúngicos oportunistas responsáveis por altas taxas de mortalidade, principalmente em pacientes imunocomprometidos, que se infectam após inalação dos conídios presentes no ar. O derivado azólico voriconazol (VRZ) é a primeira linha na terapia e o surgimento de isolados de A. fumigatus resistentes a este e outros azólicos está sendo investigado em diversos países. Isolados resistentes apresentam mutações no gene cyp51A, que codifica a 14?-demetilase, enzima alvo para estes compostos. No Hospital de Clínicas da Unicamp (HC-Unicamp) muitos pacientes de alto risco estão suscetíveis a agentes infecciosos oportunistas como os do gênero Aspergillus. Estudos recentes demonstraram que os pacientes podem estar colonizados ou infectados com mais de um genótipo de A. fumigatus e ainda que esses podem apresentar diferentes perfis frente aos antifúngicos. Análise de microssatélites (STRAF) é útil para estudar a epidemiologia molecular de A. fumigatus devido ao seu alto poder discriminatório. Desta forma, o acompanhamento do possível surgimento de isolados resistentes e a análise dos isolados sequenciais de um mesmo paciente quanto a sua genotipagem se tornam importantes. Neste contexto, o presente trabalho buscou estudar a ocorrência das espécies e o perfil de suscetibilidade de Aspergillus ambientais e clínicos frente aos antifúngicos, além de analisar a presença de mutações no gene cyp51A dos isolados de A. fumigatus resistentes aos azólicos seguida da genotipagem de A. fumigaus clínicos e ambientais. Duzentos e vinte e nove isolados clínicos e 123 isolados ambientais foram estudados. Para a identificação de espécies foi realizado sequenciamento de DNA das regiões ITS e ?-tubulina. O perfil de suscetibilidade aos antifúngicos foi avaliado de acordo com o documento M38-A2 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2008) para determinação da concentração efetiva mínima (CEM) para as equinocandinas e concentração inibitória mínima (CIM) para os demais. Os antifúngicos avaliados foram anfotericina B (AMB) itraconazol (ITZ), voriconazol (VRZ), posaconazol (PSZ), micafungina (MCF) e caspofungina (CPF). Isolados clínicos resistentes aos azólicos e os isolados ambientais de A. fumigatus foram submetidos ao sequenciamento do gene cyp51A. A tipagem de A. fumigatus por microssatélites foi realizada por sequenciamento dos pares de oligonucleotídeos iniciadores: 2AB, 3AB, 4AB, BDA, BDB, BDC e BDD e analisada com auxílio do programa e-Burst v.3. Dez isolados de A. fumigatus apresentaram valores elevados de CIM para pelo menos um azólico, mas mutações no gene cyp51A relacionadas com resistência não foram observadas. A observação mais preocupante foi que valores de CIM de AMB foram elevados (?2 mg L-1) em 87% dos pacientes com isolados de A. flavus e 43% com isolados de A. fumigatus. Não foi observada resistência às equinocandinas. Quanto a genotipagem, os isolados de A. fumigatus apresentaram elevada diversidade. Seis isolados de 3 pacientes foram englobados como parte de um complexo clonal. Estes 6 isolados possuem as já conhecidas mutações de ponto F46Y, M127V, N248T, D225E e E427K no gene cyp51A. Fazer parte desse complexo clonal significa que os isolados têm a mesma origem clonal, mas com 1 a 3 ST de diferença. Os resultados confirmam estudos anteriores que mostraram o alto polimorfismo das populações de A. fumigatus. A heterogeneidade dos genótipos confirma que um paciente pode estar contaminado ou infectado com diferentes isolados e diferentes pacientes podem ser infectados com genótipos diferentes ou, por outro lado, com genótipos muito próximos sugerindo, neste caso, a possibilidade de infecção durante internação hospitalar. Dado que a AMB é usada para tratar infecções resistentes aos azólicos, os dados obtidos no presente trabalho quanto a este antifúngico destacam a necessidade de vigilância contínua em Aspergillus para toda a resistência antifúngica a fim de permitir a implementação de estratégias de tratamento corretas para o manejo desses patógenos. Nenhuma mutação no gene cyp51A que tenha sido relacionada com resistência foi observada, nem mesmo em isolados resistentes aos azólicos, indicando que outros mecanismos podem estar envolvidos. Estudos adicionais serão necessários para um maior entendimento da epidemiologia e a heterogeneidade desses patógenos, além dos mecanismos envolvidos na resistência não apenas aos antifúngicos azólicos mas também frente a AMB e às equinocandinasAbstract: Members of the Aspergillus genus are opportunistic fungal pathogens responsible for high mortality rates, especially in immunocompromised patients, who become infected after inhalation of conidia present in the air. The azole voriconazole (VRZ) is the first line in therapy and the emergence of resistant A. fumigatus isolates to this and other azole is being investigated in several countries. Resistant isolates have mutations in the cyp51A gene, which encodes 14?-demethylase, the target enzyme for these compounds. In the Hospital de Clínicas of Campinas University (HC-Unicamp) many high-risk patients are susceptible to opportunistic infectious agents like those of the genus Aspergillus. Recent studies have shown that patients may be colonized or infected with more than one A. fumigatus genotype and that they may present different susceptibility profiles. Microsatellite analysis (STRAF) is useful for studying the molecular epidemiology of A. fumigatus due to its high discriminatory power. In this way, monitoring the possible emergence of resistant isolates and analyzing the sequential isolates from the same patient regarding their genotyping become important. In this context, the present work aimed to study the occurrence of the species and the antifungal susceptibility profile of environmental and clinical Aspergillus, as well as to analyze the presence of cyp51A gene mutations in A. fumigatus azoles resistant isolates, followed by genotyping clinical and environmental A. fumigatus. Two hundred twenty-nine clinical isolates and 123 environmental isolates were studied. For the identification of species, DNA sequencing of the ITS and ?-tubulin regions was performed. The antifungal susceptibility profile was evaluated according to the M38-A2 of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2008) to determine the minimum effective concentration (MEC) for the echinocandins and minimum inhibitory concentration (MIC) for the others. The antifungal agents evaluated were amphotericin B (AMB) itraconazole (ITZ), voriconazole (VRZ), posaconazole (PSZ), micafungin (MCF) and caspofungin (CPF). Clinical azoles resistant A. fumigatus and environmental A. fumigatus were submitted to the cyp51A gene sequencing. A. fumigatus isolates were submitted to microsatelites typing (STRAfs 2AB, 3AB, 4AB, BDA, BDB, BDC and BDD) to assess if the serially isolates were genetically related and then they were analyzed with e-Burst v.3. Ten isolates of A. fumigatus showed high MIC values for at least one azole, but mutations in the cyp51A gene related resistance were not observed. The most disturbing observation was that the MIC values of AMB were high (?2 mg L-1) in 87% of the patients with A. flavus isolates and 43% with A. fumigatus isolates. No resistance to echinocandins was observed. Regarding to genotyping, A. fumigatus showed high diversity. Six isolates of three patients were part of a clonal complex. These 6 isolates have the already known point mutations F46Y, M127V, N248T, D225E and E427K in the cyp51A gene. Being part of this clonal complex means that the isolates have the same clonal origin, but with 1 to 3 STs of difference. Our results confirm previous studies showing the high polymorphism of A. fumigatus populations. The heterogeneity of the genotypes confirms that a patient may be colonized or infected with different isolates and different patients may be infected with different or, on the other hand, infected with very close genotypes suggesting, in this case, the possibility of infection during hospitalization. Since AMB is used to treat azole-resistant infections, the data obtained in the present study highlight the need for continuous resistance surveillance in Aspergillus for all important antifungal to implement correct treatment strategies for the management of these pathogens. No related to resistance mutation in cyp51A gene was observed, not even in those azole-resistant isolates, suggesting that other mechanisms may be involved. Further studies will be necessary to better understand the epidemiology and heterogeneity of these pathogens, as well as the resistance mechanisms involved not only to azole antifungals but to AMB and echinocandinsDoutoradoCiencias BiomedicasDoutora em Ciências Médicas870369/1997-088881.134235/2016-01CNPQCAPE
