Giardia spp. cysts : detection in raw water from water treatment plants and assessment of chemical disinfectants efficacy using Direct Immunofluorescence Assay, Propidium Monoazide coupled with Polymerase Chain Reaction, and in vivo assay

Abstract

Orientador: José Roberto GuimarãesTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Civil, Arquitetura e UrbanismoResumo: Atualmente, doenças diarreicas ainda acometem cerca de 1,7 bilhão de crianças a cada ano. O protozoário parasito Giardia duodenalis é reconhecido como um dos principais agentes causadores de diarreia em humanos, e a veiculação hídrica é considerada uma das principais vias de transmissão da giardiose. O objetivo geral do presente estudo foi avaliar a resistência de cistos ¿ forma infectante ¿ de Giardia a agentes desinfetantes utilizados no tratamento de água para abastecimento público, com ênfase no ozônio. O trabalho foi desenvolvido em três etapas principais: 1) Detecção de cistos de Giardia em diferentes pontos de estações de tratamento de água (ETA) de ciclo completo: i) água bruta, ii) água pré-clorada, e iii) água pré-ozonizada. Com utilização da Reação de Imunofluorescência Direta (IFA), foram avaliadas: a) frequência de detecção e concentração de cistos de Giardia, e b) presença de danos nos cistos detectados. 2) Ozonização (5 mg?L?1) ¿ em escala de bancada ¿ de água bruta do rio Atibaia, inoculada com cistos de Giardia duodenalis. A eficiência da desinfecção foi determinada por: a) IFA, b) corante vital Propídio Monoazida (PMA) conjugado com Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), e c) ensaio in vivo. 3) Experimentos ¿ em escala de bancada ¿ de desinfecção com cloro, ozônio e peróxido de hidrogênio em água ultrapura inoculada com cistos de G. duodenalis. As eficiências foram avaliadas com uso de PMA conjugado com PCR quantitativa em tempo real (qPCR). Na etapa 1, cistos de Giardia foram detectados na água bruta (n = 30) em todas as estações do ano ¿ primavera (7/8), verão (4/4), outono (7/10) e inverno (8/8) ¿ com frequência de 86,6%. A concentração média de Giardia (cistos?L?1) foi maior em água bruta (26) do que em água clorada (15,7) ou ozonizada (11,1), e cistos danificados foram detectados com maior frequência em água ozonizada (80%), do que em água clorada (68,2%) ou bruta (37,7%). Na etapa 2, a dosagem de ozônio não produziu inativação completa dos cistos de G. duodenalis, no entanto, a ozonização reduziu a capacidade dos cistos desenvolverem infecção em camundongos BALB/c, e a detecção por IFA de cistos danificados foi confirmada por PMA-PCR. Na etapa 3, a aplicação de peróxido de hidrogênio (100 mM, 0,340%/120 minutos) ou cloro livre (? 0,9 mg?L?1/120 minutos) resultou em ? 3 log (99,9%) de inativação de cistos de G. duodenalis, e o emprego de ozônio alcançou a mesma eficiência em um tempo de contato de 3 minutos. O uso de PMA-qPCR fornece resultados quantitativos em um curto período, enquanto a nested-PCR gera resultados qualitativos, que ¿ com uso de software para processamento de imagens ¿ podem ser interpretados de modo semi-quantitativo. Os ensaios in vivo demandam muito tempo para a obtenção dos resultados, e envolvem questões de ética no uso de animais de laboratório. Embora o uso de PMA-PCR seja muito atraente para avaliar a eficiência de desinfetantes químicos, ainda não há relatos de associação direta com resultados obtidos em ensaios in vivoAbstract: Currently, diarrhoeal disease still affects around 1.7 billion children every year. The protozoan parasite Giardia duodenalis is recognized as a major cause of diarrhoea in humans, and waterborne transmission is one of the primary infection routes. The general aim of the present study was to assess Giardia cyst ¿ infectious stage ¿ resistance to disinfection agents used in water treatment for public supply, with emphasis on ozone. This work was developed in 3 main steps: 1) Detection of Giardia cysts at three sampling points at conventional water treatment plants (WTP): i) raw water, ii) pre-chlorinated water, and iii) pre-ozonated water. Using the Direct Immunofluorescence Assay (IFA), there were evaluated: a) Giardia cyst detection frequency and concentration, and b) presence of damages in detected cysts. 2) Ozonation (5 mg?L?1) ¿ in bench scale ¿ of raw water from the river Atibaia, spiked with Giardia duodenalis cysts. The disinfection efficacy was determined by: a) IFA, b) vital dye Propidium Monoazide (PMA) coupled with Polymerase Chain Reaction (PCR), and c) in vivo assay. 3) Disinfection experiments ¿ in bench scale ¿with chlorine, ozone and hydrogen peroxide against G. duodenalis cysts in distilled water. The disinfection efficacies were evaluated using PMA coupled with real time quantitative PCR (qPCR). In Step 1, Giardia cysts were detected in raw water (n = 30) at all seasons ¿ spring (7/8), summer (4/4), autumn (7/10) and winter (8/8) ¿with 86.6% detection frequency. The mean concentration of Giardia (cysts?L?1) was greater in raw water (26) than in chlorinated water (15.7) or ozonated water (11.1), and damaged cysts were detected more frequently in ozonated water (80%), than in chlorinated water (68.2%) or raw water (37.7%). In Step 2, ozone dosage did not yield complete inactivation of G. duodenalis cysts, however, ozonation reduced the ability of cysts to develop infection in BALB/c mice, and the presence of damaged cysts visualized by IFA was confirmed by PMA-PCR. In Step 3, treatment with hydrogen peroxide (100 mM, 0.340%/120 minutes) or free chlorine (? 0.9 mg?L?1/120 minutes) resulted in ? 3 log (99.9%) reduction of G. duodenalis cysts, and disinfection with ozone achieved the same efficacy within 3-minute contact time. The use of PMA-qPCR provides quantitative results in a short period of time, whereas nested-PCR generates qualitative results, which ¿ using a software for image processing ¿ can be interpreted in a semi-quantitative way. In vivo assays demand a long period of time to obtain the results, and involve ethical issues related to animal models. Although PMA-PCR is very attractive to assess the efficacy of chemical disinfectants, an association between results obtained by in vivo assays and the PMA-PCR approach has not been reported yetDoutoradoSaneamento e AmbienteDoutora em Engenharia CivilCAPE