Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães PereiraTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Visando limitar o aumento da temperatura global, políticas de descarbonização para redução da emissão de gases causadores do efeito estufa e extinção do uso de fontes fósseis têm sido adotadas mundialmente. Para atingir sua meta, o governo brasileiro visa reestruturar sua matriz energética, incentivando o desenvolvimento de tecnologias que empregam energia renovável. O etanol de segunda-geração (2G), produzido a partir dos polissacarídeos que compõem a parede celular vegetal, é uma promissora alternativa na produção de combustíveis gerados de fontes renováveis e de resíduos lignocelulósicos produzidos em abundância pela agroindústria. O desenvolvimento de linhagens microbianas eficientes, capazes de converter o açúcar de cinco carbonos xilose em etanol é um passo essencial na viabilização da tecnologia de etanol 2G. Nesse trabalho, utilizamos a linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae PE-2, condicionada ao processo 1G no Brasil, como plataforma para introdução dos genes relacionados a via de consumo de xilose. Para esse fim, foram construídas linhagens utilizando as duas vias conhecidas de conversão de xilose: a via Xilose Redutase ¿ Xilitol Desidrogenase (XR-XDH) e a via Xilose Isomerase (xylA). Utilizando procedimentos de engenharia metabólica e evolutiva, nós construímos uma série de linhagens com eficiente conversão de xilose em etanol, apresentando rendimentos de até 0,46 g etanol/g xilose. Diferentes abordagens visando a regulação do balanço redox e otimização da produção de etanol em linhagens contendo os genes da via XR-XDH foram aplicadas, bem como foram avaliadas as perturbações geradas pelas diferentes manipulações genéticas. Em linhagens contendo a via da xilose isomerase, o sequenciamento genômico de linhagens isoladas de experimentos de evolução adaptativa independentes identificou amplificações in tandem de 16 a 43 cópias de xylA integradas no genoma. Entre as mutações pontuais identificadas, a inativação de ISU1, que codifica uma proteína mitocondrial envolvida na montagem de clusteres de Fe-S e de SSK2, componente da via de osmorregulação MAPKKK, confere as linhagens a capacidade de consumir xilose sem a necessidade do procedimento de evolução. Além disso, a adição do íon Fe2+ aumenta a capacidade fermentativa de xilose mesmo de células não evoluídas, identificando um potencial aditivo para tecnologias de segunda-geração. Além de ISU1 e SSK2, foram identificadas mutações na ciclina G1 CLN3, no regulador transcricional TUP1, no componente da via das pentoses fosfato ZWF1 e em NAB3, envolvido na formação de mRNAs, snRNAs e snoRNAs. As relações encontradas entre essas diferentes vias metabólicas evidenciam diversas soluções evolutivas conectadas ao mesmo sistema de sinalização para regulação da fermentação de xilose. A identificação de novas mutações relacionadas ao consumo de xilose permite o desenvolvimento de novos alvos metabólicos para a engenharia racional de leveduras, além de reforçar a compreensão da base genética e da interação da complexa rede metabólica envolvida na fermentação de xilose em S. cerevisiae. As informações obtidas podem ser utilizadas na construção de cepas com maior capacidade de assimilação de xilose, apropriadas para serem utilizadas na produção e viabilização da tecnologia de etanol 2G. Da Ciência à Indústria - a levedura desenvolvida nesse trabalho atualmente é utilizada industrialmente na conversão dos açúcares provenientes da biomassa em etanol 2GAbstract: In order to limit global temperature warming, decarbonization policies to mitigate greenhouse gas emissions and to extinguish the use of fossil fuels have been adopted worldwide. The Brazilian government aims to restructure its energy matrix, encouraging the development of renewable energy technologies. Second generation ethanol (2G), produced from polysaccharides from plant cell wall, is a promising alternative for production of fuels obtained from renewable sources and lignocellulosic wastes produced in abundance by the agroindustry. The development of efficient microbial strains capable of converting the five-carbon sugar xylose into ethanol is an essential step in the 2G ethanol technology. In this work, we used the industrial strain Saccharomyces cerevisiae PE-2, conditioned to the 1G process in Brazil, as a platform for introducing the genes from xylose consumption pathway. Strains were constructed using the two xylose conversion pathways: the Xylose Reductase and Xylitol dehydrogenase (XR-XDH) pathway and the Xylose Isomerase (xylA) pathway. Using metabolic and evolutionary engineering procedures, we constructed several efficient xylose-to-ethanol conversion strains with yields of 0.46 g ethanol/ g xylose. Different approaches for adjusting the redox balance and optimization of ethanol production in XR-XDH strains were applied, and the perturbations generated by different genetic manipulations were evaluated. Whole-genome sequencing of strains harboring the xylose isomerase pathway, isolated from independent adaptive evolution experiments identified in tandem amplifications of 16 to 43 xylA copies integrated into the genome. The inactivation of ISU1, which encodes a mitochondrial scaffold protein in the assembly of Fe-S clusters and SSK2, a member of the MAPKKK signaling pathway, confers the yeast cells the ability to metabolize xylose without adaptive evolution. Furthermore, addition of Fe2+ ion improved xylose fermentation even by non-evolved cells, identifying a potential additive for second-generation technologies. Besides ISU1 and SSK2, point mutations were identified in G1 cyclin CLN3, the transcriptional regulator TUP1, the pentose phosphate pathway member ZWF1 and NAB3, required for termination of mRNAs, snRNAs and snoRNAs transcripts. The interactions found between these different metabolic pathways show diverse evolutionary solutions connected to the same signaling system for xylose metabolism regulation. The new mutations related to the xylose consumption allows the development of key metabolic targets for rational engineering of yeast cells, and allows the uncovering of the genetic basis and the complex regulatory network interaction involved in the xylose fermentation in S. cerevisiae strains. This information can be used for construction of strains with higher performance in xylose fermentation, suitable for 2G ethanol production. From Science to Industry ¿ the yeast developed in this work is currently industrially used in the conversion of sugars from biomass to 2G ethanolDoutoradoGenetica de MicroorganismosDoutor em Genetica e Biologia Molecula
