Pathogen derived resistance mediated by toxin of toxin-antitoxin system from Xylella fastidiosa

Abstract

Orientador: Alessandra Alves de SouzaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A laranja doce é uma das culturas mais importantes produzidas no Brasil dada a sua importância econômica para a agricultura nacional. Contudo, esse setor vem sofrendo grandes perdas econômicas devido a problemas de ordem fitossanitária como doenças e pragas. Dentre esses, as doenças bacterianas como a Clorose Variegada dos Citros (CVC), causada pela bactéria Xylella fastidiosa, e o Cancro Cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri, causam grandes prejuízos para a produção de laranja doce. Dentre as tecnologias que visam a obtenção de plantas resistentes a fitopatógenos, a transgenia apresenta-se como uma ferramenta biotecnológica para a obtenção de variedades tolerantes/resistentes a diferentes patógenos. Dentro das estratégias de transgenia, a resistência derivada do patógeno (RDP) tem demonstrado ser promissora para o controle dos fitopatógenos de citros. Nesta vertente, um possível candidato para conferir tolerância a CVC e ao cancro cítrico seria o gene mqsR que codifica uma toxina de um sistema toxina-antitoxina de X. fastidiosa. Essa toxina é uma endorribonuclease e já foi descrita por abolir a patogenicidade de X. fastidiosa quando a bactéria superexpressa a mesma. Dessa forma, MqsR possui potencial para transformação genética de plantas visando tolerância a X. fastidiosa, podendo levar à inibição do crescimento e, consequentemente, redução na colonização da bactéria e dos sintomas. X. citri não possui esse sistema toxina-antitoxina homólogo em seu genoma, em função disso, plantas transgênicas superexpressando a toxina MqsR poderiam também interferir na colonização dessa bactéria, diminuindo os sintomas de Cancro Cítrico. Nesse estudo, plantas transgênicas de tabaco e citros superexpressando a toxina MqsR foram obtidas, e a presença do transgene foi confirmada por GUS, PCR, expressão gênica e proteica. Essas plantas foram desafiadas com X. fastidiosa e demonstraram redução da sintomatologia comparadas às plantas não transformadas. Também foi verificado que a população de X. fastidiosa foi significativamente menor nas plantas transgênicas, demonstrando que possivelmente a toxina interferiu na multiplicação e colonização da bactéria e, consequentemente, reduziu os sintomas da doença. Também foi verificado que a toxina MqsR pôde penetrar nas células de X. citri e inibir o seu crescimento. Em folhas destacadas das plantas transgênicas de citros infiltradas com X. citri foi verificada redução da colonização e população da bactéria, sendo possível detectar a toxina dentro da célula da bactéria, demonstrando que, assim como observado para X. fastidiosa, a toxina MqsR também alterou o comportamento de X. citri. Dando suporte ao fenótipo observado, foi demonstrada a repressão de genes associados à multiplicação e colonização da bactéria. Em casa de vegetação também foi observada redução na severidade de sintomas nas plantas transgênicas ao longo do tempo. Desse modo os resultados sugerem que a toxina superexpressa pela planta pode interferir na multiplicação e colonização de X. fastidiosa e X. citri, promovendo tolerância a ambos os patógenosAbstract: Sweet orange is one of the most important cultures produced in Brazil given its economic importance for national agriculture. However, this sector suffers big losses due phytosanitary problems as diseases and pests. Among them, the bacterial diseases such as Citrus Variegated Chlorosis (CVC) caused by Xylella fastidiosa, and citrus canker, caused by Xanthomonas citri subsp. citri generate big losses to sweet orange production. Among the technologies that aim to obtain resistance to plant pathogens, transgenesis can be used as a biotechnological tool to obtain tolerant/resistant plants for different pathogens. Among strategies of transgenesis, pathogen derived resistance (PDR) has been showed promising to control citrus pathogens. In this way, a possible candidate gene to confer tolerance against CVC and citrus canker would be the mqsR gene, which encodes a toxin of a toxin-antitoxin system from X. fastidiosa. This toxin is an endoribonuclease and was already described to abolish the pathogenicity of X. fastidiosa when the bacterium overexpress the toxin. In this way MqsR has potential for genetic transformation of plants aiming tolerance to X. fastidiosa, being able to inhibit growth, consequentely, reduce bacterial colonization and symptoms. X. citri does not have an homologous of this TA system in its genome, thus, transgenic plants overexpresing MqsR toxin could also interfere in X. citri colonization, decreasing the symptoms of citrus canker. In this study, were obtained transgenic plants of tobacco and citrus overexpressing the MqsR toxin, which were confirmed by GUS, PCR, gene and protein expression. These plants were challenged with X. fastidiosa and showed a reduction of symptoms when compared with non-transformed plants. Also it was verified that the population of X. fastidiosa was significantly smaller in transgenic plants, showing that the toxin possibly interfered with bacterial multiplication and colonization and, consequently, decreased the disease symptoms. It was also verified that the MqsR toxin could penetrate in X. citri cells and inhibit their growth. In detached leaves of transgenic citrus plants infiltrated with X. citri was verified a reduction of bacterial colonization and population, and the toxin was detected inside the bacterial cells, showing that, as observed in X. fastidiosa, the MqsR toxin altered the behavior of X. citri. Supporting the observed phenotype, it was showed a repression of genes associated with bacterial multiplication and colonization. In greenhouse conditions, it was also verified a reduction of severity of symptoms in transgenic plants in a time course experiment. Therefore, the findings suggest that the toxin overexpressed by the plant can be interfering with the multiplication and colonization of X. fastidiosa and X. citri, leading to tolerance to both pathogensMestradoGenetica Vegetal e MelhoramentoMestre em Genética e Biologia Molecular2013/21924-6FAPES