Effects of valproic acid and trichostatin A on chromatin organization and its regulation by epigenetic factors in HepG2 cell grown under hyperglycemic conditions
Orientador: Maria Luiza Silveira MelloTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Diabetes é uma doença complexa com diversos fatores, entre os quais epigenéticos, afetando seu desenvolvimento. Uma estratégia potencial para reverter mudanças epigenéticas associadas a várias doenças é o uso de inibidores de deacetilases de histonas (HDACis). Tem sido relatado o papel de HDACi, como o ácido valproico (VPA) e a tricostatina A (TSA), na redução da glicose plasmática, na melhoria da resistência à insulina e na redução das complicações microvasculares tardias do diabetes, assim como no controle da gliconeogênese. Além disso, HDACis têm sido apontados como novos agentes imunomoduladores, uma vez que apresentam a habilidade de reduzir a severidade de doenças inflamatórias e autoimunes. Tendo em vista que o fígado é um órgão fundamental para o metabolismo de glicose e lipídios, o presente estudo foi desenvolvido em células hepáticas HepG2, modelo usado em estudos do diabetes. Alterações na estrutura cromatínica associadas a mudanças em marcas epigenéticas e na expressão gênica foram avaliadas de maneira a se entender as consequências em larga escala da hiperglicemia, assim como da ação de HDACi nesse contexto. O tratamento com VPA e TSA sob normoglicemia promoveu remodelação cromatínica em células HepG2, identificada através da análise de imagem e da abundância das marcas H3K9ac e H3K9me2. Além disso, constatou-se migração dos sinais de H3K9ac para a periferia nuclear, acompanhada de dissociação das proteínas HP1-? das regiões heterocromáticas e de aumento na frequência de células na fase G1 do ciclo celular. A própria exposição das células à hiperglicemia foi capaz de promover alterações cromatínicas e epigenéticas semelhantes às reportadas acima. Curiosamente, quando as células foram tratadas com VPA e TSA em ambiente hiperglicêmico, os resultados não foram intensificados. Entretanto, apesar da ausência de indução de alterações morfológicas, esses tratamentos trouxeram significado fisiológico, reduzindo a produção de glicose hepática. Conclui-se que o nível de glicose do microambiente afete a maneira como a cromatina de hepatócitos responde aos HDACi e que essas respostas podem se dar mais em função dos domínios e genes diferencialmente regulados do que de uma remodelação global da cromatina. Nesse sentido, uma análise global dos genes potencialmente impactados pelo tratamento com VPA foi realizada por meio de RNA-seq, visando entender os mecanismos de ação que levam à melhoria do estado hiperglicêmico. Através de análises bioinformáticas iniciais, foi associada a ação do VPA com a modulação do sistema complemento e de coagulação. Esses sistemas apresentam origens evolutivas comuns, e entender a comunicação entre essas vias tem implicações clínicas fundamentais no contexto de doenças inflamatórias. A rede de fatores de transcrição que regula a expressão gênica parece ser o ponto de conexão entre as vias metabólicas e do sistema imune; então, compreendê-la melhor, assim como decifrar os padrões de acetilação nesses genes, irá ajudar a completar essas conclusões. Até o momento, foi possível avaliar como a hiperglicemia influencia a textura cromatínica e sua regulação epigenética, assim como desvendar como os HDACis atuam nesse contexto, mitigando a hiperglicemia através da modulação de vias gênicas até então não descritas, o que pode vir a enriquecer as abordagens terapêuticas para o diabetesAbstract: Diabetes is a complex disorder involving several factors in its progression, among which those related with epigenetics control. A potential strategy to reverse epigenetic alterations associated with diseases is the use of histone deacetylase inhibitors (HDACis). HDACis, like valproic acid (VPA) and trichostatin A (TSA) have been reported to induce plasmatic glucose reduction, mitigation of insulin resistance and decrease in microvascular late complications, as well as involvement in gluconeogenesis control. Furthermore, HDACis have been revealed as potential immunomodulatory agents, because they are capable of reducing the severity of inflammatory and autoimmune diseases. Given that the liver is a fundamental organ for lipid and glucose metabolism, this study was developed in the HepG2 hepatocyte cells model. Chromatin structure alterations associated with epigenetic and gene expression changes were evaluated aiming to understand the large-scale consequences of hyperglycemia, and the HDACi action on this context. VPA and TSA treatments in HepG2 cells under normoglycemia promoted chromatin remodeling as assessed by image analysis and evaluation of H3K9ac and H3K9me2 abundance. Simultaneously, H3K9ac marks were found to shift to the nuclear periphery accompanied by HP1 dissociation from the heterochromatin and G1 cell cycle arrest. High glucose per se promoted chromatin and epigenetic changes similar to those described above. Interestingly, these results were not intensified in cells treated with HDACis under hyperglycemic conditions. Nonetheless, despite the absence of morphological changes being promoted, HDACi treatment seems to confer a physiological meaning, through reduction of glucose production. These observations allow us to conclude that the microenvironmental glucose level affects how chromatin responds to HDACis and their action may be more concerned with chromatin domains affected and differently regulated genes not reflecting on global chromatin remodeling. A genome-wide analysis of a multitude of genes potentially influenced by VPA was attempted through RNA-seq, aiming to understand its mechanisms of action on amelioration of the hyperglycemic state. Initial bioinformatics analysis has associated VPA action with complement and coagulation gene modulation. Indeed, complement and coagulation pathways have common evolutionary origins and understanding the crosstalk between these pathways has fundamental clinical implications in the context of inflammatory diseases. The transcription factor network controlling gene expression may be the connecting point between immune system and metabolic pathways and further investigation of these gene regulators as well of the acetylation pattern of gene promoters may better complement present conclusions. Until this moment, the hyperglycemia influence on chromatin texture and epigenetic regulation, as well as unraveling of a new mechanism of mitigation of hyperglycemia have been evaluated to be promoted by VPA, which might improve the therapeutic approaches for diabetesDoutoradoBiologia CelularDoutora em Biologia Celular e Estrutural2012/03238-5FAPESPCAPESCNP
