Orientador: Kleber Gomes FranchiniTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O estudo de circuitos de sinalização celular ativados frente a estímulos fisiopatológicos constitui uma importante fronteira na pesquisa da patogênese da hipertrofia e insuficiência cardíacas. Estudos anteriores do nosso laboratório investigaram a participação de proteínas como Shp2, uma tirosino-fosfatase que é crítica para a sinalização hipertrófica de míocitos cardíacos, e CryAB (?B-Crystalina), uma chaperona altamente expressa no coração, que protege FAK contra degradação e promove a sobrevivência celular. O presente estudo demonstrou que a CryAB se associa com Shp2 e reduz sua atividade catalítica em miócitos cardíacos estirados. CryAB interage diretamente com Shp2 in vitro e em células vivas, como mostrado pelas técnicas de imunoprecipitação, pull-down, FLIM-FRET e cross-linking acoplado a espectrometria de massas. Técnicas de docking e modelagem molecular demonstraram que os domínios PTP e NSH2 da Shp2 fazem contatos no domínio alfa-cristalino da CryAB oligomérica, mantendo a estrutura autoinibida da Shp2. Somente o oligômero de CryAB, mas não o dímero, é capaz de reduzir a atividade fosfatase da Shp2 de maneira dose dependente, como mostrado por meio da quantificação da atividade tirosina fosfatase da Shp2 na presença destas proteínas. Miócitos ventriculares de ratos neonatos (MVRNs) em cultura apresentam, mediante estiramento, uma robusta associação CryAB/Shp2 e reduzida atividade tirosina fosfatase de Shp2. Adicionalmente, MVRNs submetidos a silenciamento de CryAB seguido de estiramento exibiram uma atividade de Shp2 aumentada. Os resultados indicam que a CryAB pode atuar como modulador da atividade da Shp2 em miócitos cardíacos submetidos a estresse mecânicoAbstract: The study of cell signaling circuits activated during pathophysiological stimuli is an important challenge in cardiac hypertrophy and failure pathogenesis research. Previous studies from our group have investigated the role of proteins such as Shp2 (SH2 domain-containing tyrosine phosphatase 2), a tyrosine phosphatase critical in cardiac myocytes hypertrophic signaling, and CryAB (?B-Crystallin), a molecular chaperone highly expressed in heart, which interacts with and protects FAK (Focal Adhesion Kinase) from degradation, promoting cell survival. Here we show that CryAB interacts with and regulates the tyrosine-phosphatase Shp2 catalytic activity in stretched cardiomyocytes. We used a combination of pull-down, immunoprecipitation, FRET-FLIM and chemical cross-linking coupled to mass spectrometry to show that CryAB and Shp2 directly bind in vitro and in living cells. Docking and molecular modeling showed that the PTP and NSH2 domains of Shp2 bind ACD (alpha-crystallin domain) of oligomeric CryAB, which holds Shp2 in closed and inhibited conformation. Protein tyrosine-phosphatase assays showed that the binding of CryAB oligomer, but not the dimer, is important for Shp2 stability and function, and in addition, it attenuates Shp2 activity in a dose dependent mode. Stretched Neonate Rat Ventricular Myocytes (NRVMs) show a robust CryAB/Shp2 association and reduced Shp2 phosphatase activity. In addition, NRVMs subjected to CryAB knockdown followed by mechanical stress exhibited enhanced activity of Shp2. These results indicates that CryAB might act as a modulator of Shp2 phosphatase activity in cardiomyocytes under mechanical stressDoutoradoBioquimicaDoutora em Biologia Funcional e Molecular13/05877-8FAPES
