Study of biotransformation of rye flour by enzymatic treatment and evaluation of the bioaccessibility of phenolic acids by model of digestion 'in vitro' and of absorption by Caco-2 intestinal cells

Abstract

Orientador: Gabriela Alves MacedoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: Os ácidos fenólicos possuem propriedades biológicas que desempenham ação antioxidante, anti-inflamatória, antiproliferativa e antimicrobiana. Porém, esses fenólicos de cereais integrais podem ser difíceis de serem absorvidos totalmente pelo organismo, pois estão ligados a outros componentes da parede celular do vegetal ou a um antinutriente (taninos). O zinco, ferro e fósforo de grãos integrais são importantes para o desenvolvimento e manutenção do organismo. No entanto, os cereais ricos em fitato podem apresentar esses minerais complexados ao antinutriente e se tornarem indisponíveis para a absorção. Uma alternativa para melhorar a disponibilidade de ácidos fenólicos e minerais de cereais integrais é o tratamento enzimático. A tanase, tanino acil hidrolase (EC 3.1.1.20), é uma enzima com habilidade de atuar em ligações éster e depsídicas de taninos hidrolisáveis e já foi descrita como capaz de hidrolisar outros fenólicos como ácido tânico, ácido clorogênico, epigalocatequina, dentre outros. A fitase microbiana atua na desfitinização de cereais ricos em fitatos e sua ação melhora a bioacessibilidade de ferro e zinco na formulação infantil. A bioacessibilidade é uma alternativa aos ensaios 'in vivo' que apresentam alto custo de experimental, e pode ser medida pelo modelo de digestão 'in vitro'/absorção pelas células Caco-2. O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito de tanase de 'Paecilomyces variotii' e fitase comercial, adicionadas à farinha de centeio, quanto ao teor de fenólicos totais e à identificação e quantificação por CLAE-DAD dos ácidos fenólicos; à capacidade antioxidante (DPPH, ORAC e FRAP); à disponibilidade de minerais (zinco e ferro); ao teor de antinutrientes (tanino hidrolisável e fitato); e à bioacessibilidade dos ácidos fenólicos da farinha. A tanase adicionada à farinha foi capaz de reduzir o teor de tanino hidrolisável, aumentar os fenólicos totais e potencializar a capacidade antioxidante. A farinha tratada com fitase apresentou menor teor de fitato e aumento no conteúdo de fósforo inorgânico proveniente da degradação enzimática. A disponibilidade de zinco e ferro, medida pela razão molar entre os minerais e o fitato foi melhorada após o tratamento da farinha com fitase. Foram identificados os ácidos ferúlico, sinápico e vanílico da farinha de centeio, que após o tratamento com a tanase apresentou aumento no teor de ácido ferúlico em cinco vezes em relação à farinha não tratada. Esse resultado evidencia a ação inédita da tanase de 'P. variotii' como possível feruloil esterase. A farinha biotransformada com tanase apresentou maior teor dos ácidos vanílico, ferúlico e sinápico, porém ao se avaliar a bioacessibilidade houve menor eficiência de transporte desses ácidos quando comparada à farinha controle. Provavelmente, a farinha biotransformada apresentou saturação desses fenólicos sobre a porção apical das células Caco-2 que reduziu a capacidade do transportador de ácidos monocarboxílicos (MCT1) nas duas horas de incubação. Isso corrobora com os resultados obtidos da exposição das células Caco-2 aos padrões de ácidos ferúlico e vanílico na concentração de 50 µl.ml-1 que apresentaram inibição da expressão gênica do MCT1. Contudo, o uso de enzimas como fitase e tanase na farinha de centeio é interessante, pois potencializa sua ação antioxidante, aumenta o teor de fenólicos, aumenta a disponibilidade de zinco e ferro, aumenta o conteúdo de fósforo e reduz os antinutrientes. Para trabalhos futuros seria relevante estudar o tempo de residência de ácidos fenólicos da farinha de centeio no ensaio de transporte celular, pois duas horas de incubação pode ter sido insuficiente para verificar todo o potencial da farinha tratada com tanaseAbstract: Phenolic acids have biological properties that perform antioxidant, anti-inflammatory, antiproliferative and antimicrobial. However, these phenolic of whole grains may be difficult to be completely absorbed by the body because they are connected to other cell wall components of plant or an antinutrient (tannins). Zinc, iron and phosphorus of whole grains are important for the development and maintenance of the organism. However, cereals rich in phytate may have these minerals complexed to antinutrient and become unavailable for absorption. An alternative to improve the availability of phenolic acids and minerals of whole grains is the enzymatic treatment. Tannase, tannin acyl hydrolase (EC 3.1.1.20) is an enzyme with the ability to act on ester bonds and depside bonds of hydrolysable tannins and has been described as capable of hydrolyzing tannic acid, chlorogenic acid, epigallocatechin, among others. Microbial phytase acts on dephytinization of cereals rich in phytate and its action improves the bioaccessibility of iron and zinc in infant formulation. Bioaccessibility is an alternative to in vivo tests that has expensive experimental cost, and can be measured by 'in vitro' model of digestion / absorption by the Caco-2 cells. The aim of this study was to investigate the effect of tannase Paecilomyces variotii and of commercial phytase added to rye flour, as to the total phenolic content and the identification and quantification by HPLC-DAD of phenolic acids; to the antioxidant capacity (DPPH, ORAC and FRAP); to the availability of minerals (zinc and iron); to the antinutrients content (phytate and hydrolyzable tannin); and as to bioaccessibility of phenolic acids of the flour. Tannase added to flour was able to reduce the hydrolyzable tannin content, increase total phenolic and enhance the antioxidant capacity. Flour rye treated with phytase decreased phytate content and increased content of inorganic phosphorus from enzymatic degradation. Availability of zinc and iron of the flour after treatment with phytase was improved, it was measured by the molar ratio between the mineral and phytate. Acids ferulic, sinapic and vanillic were identified and quantified of the rye flour, which after treatment with tannase showed an increase in ferulic acid content in five times bigger that the untreated flour. This result shows the tanase being an original action of 'P. variotii' as possible feruloyl esterase. Biotransformed flour rye with tannase showed a higher content of vanillic acid, ferulic and sinapic, however, when assessing the bioaccessibility was lower transport efficiency of these acids when compared to the control flour. Probably the biotransformed flour showed saturation of these phenolics about the apical portion of Caco-2 cells, they reduced the capacity of the monocarboxylic acids transporter (MCT1) within two hours of incubation. This corroborates the results of exposure of Caco-2 cells to standards of ferulic acid and vanillic at concentration of 50 ?l.mL-1, that showed inhibition of gene expression MCT1. However, the use of enzymes such as phytase and tannase in rye flour is interesting because it enhances antioxidant capacity, it phenolic content is incremented, availability of zinc and iron is bettered, increases the phosphorus content and reduces antinutrients. For further work, would be relevant the study of the residence time of the phenolic acids of rye flour on the cell transport assay, since two hours of incubation may have been insufficient to verify the full potential of flour treated with tannaseDoutoradoCiência de AlimentosDoutora em Ciência de Alimento