Genetic study of hereditary hearing loss with new technologies based on array-CGH and next-generation sequencing

Abstract

Orientador: Edi Lúcia SartoratoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A perda auditiva é uma das desordens sensoriais mais comuns em humanos. A identificação de alterações genéticas associadas à surdez pode contribuir para uma melhor compreensão das bases moleculares e dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos nos diferentes fenótipos das perdas auditivas hereditárias. Além disso, pode proporcionar um diagnóstico preciso, desenvolvimento de tratamentos mais específicos e aconselhamento genético para pacientes e famílias. No entanto, a elevada heterogeneidade clínica e genética da perda auditiva dificulta o diagnóstico molecular. Até o momento, já foram descritos mais de 90 genes e 150 loci envolvidos com perdas auditivas não-sindrômicas e pelo menos 40 genes associados aos principais tipos de surdez sindrômica. Com a aplicação de tecnologias de nova geração é possível otimizar o diagnóstico genético e realizar uma investigação mais ampla das perdas auditivas hereditárias. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi esclarecer a etiologia genética em uma amostra de indivíduos brasileiros com perdas auditivas associadas a distintos padrões de herança, mediante aplicação de tecnologias de nova geração (array-CGH e next-generation sequencing). Foram analisados casos esporádicos ou familiares com perda auditiva neurossensorial bilateral, para os quais foram excluídos fatores ambientais e as principais mutações relacionadas à perda auditiva de origem genética. Foi realizado o estudo molecular de 19 pacientes mediante a aplicação do OTO-NGS-Panel, um painel de captura de sequências dirigido a 71 genes envolvidos com perdas auditivas hereditárias para sequenciamento massivo, desenvolvido no Departamento de Genética do Hospital Ramón y Cajal, Madri/Espanha. Foram identificadas alterações patogênicas em nove dos 19 pacientes (47,4%). Doze mutações em sete genes distintos foram detectadas, com destaque para sete mutações que estão sendo descritas pela primeira vez neste trabalho. Dentre os genes envolvidos estavam: CDH23 e OTOF, relacionados à surdez de herança autossômica recessiva; DFNA5, ACTG1, COCH e CRYM, associados à perda auditiva de herança autossômica dominante; e PRPS1 envolvido com a perda auditiva de herança ligada ao cromossomo X. Foram pesquisadas deleções e inserções em seis pacientes com surdez de herança autossômica recessiva, mediante hibridação genômica comparativa baseada em array (array-CGH). Foi utilizado o OTO-CGH array, desenvolvido no Departamento de Genética do Hospital Ramón y Cajal, Madri/Espanha, que permite a análise de loci e genes associados à perda auditiva de herança autossômica recessiva. Porém, não foram encontradas alterações patogênicas que pudessem ser relacionadas à surdez nesses casos. A pesquisa de alterações moleculares em uma amostra de pacientes brasileiros com perdas auditivas hereditárias, mediante a aplicação de tecnologias de nova geração, possibilitou a identificação de mutações em 47,4% dos casos. O OTO-NGS-Panel é eficiente para detectar a etiologia genética em um grupo heterogêneo de pacientes. Além de permitir a identificação de mutações novas, essa abordagem nos possibilitou reportar o envolvimento de genes nunca antes investigados na população brasileira. Já o OTO-CGH array não contribuiu para a elucidação da causa da surdez nos casos analisados. Este trabalho foi importante para introduzir informações a respeito da epidemiologia genética da perda auditiva no Brasil e também para adicionar novos dados referentes à diversidade de mutações que ocorrem nos genes relacionados à surdezAbstract: Hearing loss is one of the most common sensory disorders in humans. The identification of genetic variants associated with deafness can contribute to a better understanding of the molecular basis and the pathophysiological mechanisms involved in the different phenotypes of hereditary hearing loss. Moreover, it can provide an accurate diagnosis, development of specific treatments and genetic counseling for patients and families. However, molecular diagnosis has been a challenge, mainly due to clinical and genetic heterogeneity of hearing loss. To date, more than 90 genes and 150 loci have been described for nonsyndromic hearing loss and at least 40 genes have been linked to the main types of syndromic hearing loss. The application of new high-throughput technologies allows an optimization of genetic diagnosis and a comprehensive investigation of hereditary hearing loss. Therefore, the main goal of the present study was to elucidate the genetic etiology in a cohort of Brazilian subjects with hearing loss associated with different inheritance patterns, using next-generation technologies (array-CGH and next-generation sequencing). We investigated unrelated sporadic or familial patients with bilateral sensorineural hearing loss, for whom environmental factors and the most frequent mutations associated with genetic hearing loss have been excluded. Nineteen patients were screened using the OTO-NGS-Panel, a targeted next-generation sequencing panel containing 71 genes already known to be involved in hereditary hearing loss, designed by the Genetic Department at the Hospital Ramón y Cajal, Madrid-Spain. Pathogenic variations were identified in nine out of 19 patients (47.4%). Twelve mutations in seven different genes were detected, highlighting seven mutations that are being described for the first time in the present work. The following genes were involved: CDH23 and OTOF, related to autosomal recessive hearing loss; DFNA5, ACTG1, COCH and CRYM, associated with autosomal dominant hearing loss; and PRPS1, responsible for X-linked hearing loss. Deletions and insertions were investigated in six patients with autosomal recessive deafness using array-based comparative genomic hybridization (array-CGH) technology. The OTO-CGH array, designed by the Genetic Department at the Hospital Ramón y Cajal, Madrid-Spain, which allows the analysis of loci and genes associated with autosomal recessive hearing loss, was employed. However, no pathogenic variations that could explain the etiology of hearing loss for these cases were found. Molecular investigation in a cohort of Brazilian patients with hereditary hearing loss using next-generation technologies allowed the identification of mutations in 47.4% of cases. Our study demonstrates the usefulness of the OTO-NGS-Panel for detecting the genetic etiology of hearing loss in a heterogeneous group of patients. In addition to the identification of novel mutations, this approach enabled us to report the involvement of genes that had never been investigated before in the Brazilian population. On the other hand, the OTO-CGH array has not been successful in elucidating the cause of deafness in the cases analyzed. This work was important to introduce information to the genetic epidemiology of hearing loss in Brazil and also to add new data to the diversity of mutations occurring in genes related to deafnessDoutoradoGenetica Animal e EvoluçãoDoutora em Genética e Biologia Molecular229880/2013-4CAPESCNP