Seleção e caracterização taxonomica de leveduras produtoras de inulinases

Abstract

Orientador: Vanderlei Perez CanhosTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: Com o objetivo de obter leveduras produtoras de inulinases com propriedades biotecnológicas interessantes fez-se o isolamento de leveduras a partir de suco da planta Agave e resíduos da indústria de si sal (substratos ricos em inulina). Para a seleção de linhagens tolerantes a pH baixo e altas temperaturas, utilizou-se o sistema "Microtiter Reader" automatizado para reduzir tempo, custo e mão-de-obra. A caracterização taxonômica incluiu técnicas convencionais, quimiotaxonômica e taxonomia numérica. Foram isoladas 79 leveduras a partir de 4 locais de coleta em condição seletiva (meio de cultura contendo inulina em diferentes temperaturas). A caracterização morfológica e bioquímica, junto com a determinação do tipo de coenzima-Q (quinona) foram utilizadas na identificação de 73 leveduras ascomicéticas compreendendo os estados anamórficos: 42 linhagens de Candida kefyr (estado teleomórfico Kluyveromyces marxianus); 11 linhagens de Candida lusitaniae (estado teleomórfico Clavispora lusitaniae) e 6 linhagens de Candida guilhermondii (estado teleomórfico Pichia guilhermondii); 14 isolados semelhantes à espécie Pichia strasburgensis, que não apresentaram reprodução sexuada; e 6 leveduras deuterornicéticas identificadas como pertencentes à espécie Rhodotorula rubra. Na análise por taxonomia numérica, utilizou-se 58 características fenotípicas para o cálculo da similaridade entre as leveduras (coeficientes "simple matching" e Jaccard) e foram construídos dendogramas através dos programas computacionais X e NTSYS. As leveduras foram agrupadas em sete "clusters". Três "clusters" Q6, Q7 e QIO apresentaram boa definição e incluíram 18 linhagens de Candida kefyr, 10 linhagens de Pichia strasburgensis e os 6 representantes da espécie Rhodotorula rubra, respectivamente. Um "cluster", denominado Major, apresentou-se heterogêneo reunindo linhagens das espécies C. kefyr (24), C. lusitaniae (8), C. guilhermondii (3) e Pichia strasburgensis (2) confirmando a semelhança em relação às características morfológicas e bioquímicas observada na taxonomia convencional, na ausência das características relacionadas à reprodução sexuada. A estratégia de seleção utilizada comprendeu o teste do crescimento dos isolados em meios mínimo (YNB) e complexo (YEP) acrescidos de inulina em diferentes condições de pH e temperatura. Os dados de cinética de crescimento foram comparados e foram selecionadas 20 linhagens de Candida kefyr com constante específica de crescimento (?máx)?0,50 em meio mínimo (YNB) pH 4,0 e a temperatura de 50°C. Onze linhagens apresentaram atividade enzimática superior à obtida para a cultura referência Kluyveromyces marxianus CBS 6556 no menor tempo testado (12 horas). A linhagem Candida kefyr A54a mostrou atividade inulolítica de 2,31 U a 12 horas de produção comparável à linhagem referência (2,64 U) em 18 horas de produçãoAbstract: Aiming to obtain inulinase-producing yeasts with interesting biotechnological properties the isolation of yeasts from Agave juice and from sisal industry residues (substrates rich in inulin) was carried on. For the screening of low pH and high temperature tolerant strains an automated microtiter reader system was utilized to reduce time, cost and work. The taxonomic characterization was performed using conventional and chemotaxonomic and numerical approaches. Were isolated 79 yeast strains from four sampling places on selective condition (culture medium with inulin at high temperatures). The morphological and biochemical characterization together with the coenzyme-Q type determination were utilized for the identification of 73 ascomycetous yeasts in anamorph state that include: 42 strains of Candida ke.fyr (sexual state Kluyveromyces marxianus); 11 strains of Candida lusitaniae (sexual state Clavispora lusitaniae); 6 strains of Candida guilhermondii (sexual state Pichia guilhermondii) and 14 isolates analogous to Pichia strasburgensis that did not show sexual reproduction and 6 deuteromycetous yeasts identified as Rhodotorula rubra. In the numerical analysis 58 phenotypic characters were utilized to ca1culated the similarity between isolates (simple matching and Jaccard coefficients) and c1ustering using X and NTSYS softwares. The yeasts were c1ustered on seven groups. The clusters Q6, Q7 e QlO presented a good definition and grouped 18 strains of C. ke.fyr, 10 strains of P. strasburgensis-lik.e and 6 strains of Rhodotorula rubra, respectively. One c1uster, defined Major, formed an heterogeneous group, c1ustering strains of C. ke.fyr (24), C. lusitaniae (8), C. guilhermondii (3) e P. strasburgensis (2) that confirms the similarity of these species based on the morphological and biochemical characteristics as shown by conventional taxonomy on absence of sexual reproduction. The screening strategy used included growth test at minimal medium YNB and complex medium YEP with inulin 1 % at different pH and temperature conditions. Kinetics data were compared and twenty strains were selected that presented specific growth constant (?máx)?0,50 h-1 at YNB pH 4,0 50°C condition. Of these, eleven strains of Candida kefyr showed inulolitic activity greater than reference culture (K. marxianus CBS 6556) with 12 hours of production. The strain C. ke.fyr A54a showed AE = 2,31 U (?moles of fructose per minute) at 12 hours of production, this value was comparable to strain K. marxianus CBS 6556 at 18 hours (2,64 U)DoutoradoDoutor em Ciência de Alimento