The aim of our in vitro experiments was to study the role of growth factors and protein
kinase A (PKA)-dependent intracellular mechanisms in the control of nuclear maturation of
porcine oocytes. Oocytes were cultured with or without growth factors
(IGF-I, IGF-II, EGF; 10 ng⋅mL−1 medium) and inhibitors of PKA (Rp-cAMPS or KT5720;
100 ng⋅mL−1). Stages of meiosis were determined from the structure of chromosomes
after staining with Giemza. Intracellular levels of PKA were evaluated
immunocytochemically using primary antisera against the PKA regulatory
and catalytic subunits and by Western immunoblotting using primary antiserum against
the PKA catalytic subunit. It was found that after 24 h culture the majority of oocytes
had resumed nuclear maturation (they were at a stage of meiosis after diplotene)
and that after 48 h culture the majority of cells had completed maturation (they had
reached metaphase II of meiosis). Addition of IGF-I, IGF-II or EGF, or a combination of
IGF-I and EGF, significantly increased the proportion of oocytes which resumed and
completed meiosis. Immunocytochemistry demonstrated a significant increase in the
proportion of cells containing catalytic and, in some cases, the regulatory subunits
of PKA after addition of IGF-I, IGF-II and EGF. Immunoblotting showed the presence of
2 forms of the PKA catalytic subunit within the oocytes (MW approximately 52 and 40 kD).
EGF, but not IGF-I or IGF-II, increased the content of both isoforms. Inhibitors of PKA,
when given alone, did not substantially influence the proportion of oocytes which resumed
or completed meiosis. However, Rp-cAMPS and KT5720 both prevented the stimulatory effects
of IGF-I, IGF-II and EGF on the resumption and completion of oocyte maturation. The present
observations suggest (1) that IGF-I, IGF-II and EGF are potent stimulators of
both resumption and completion of porcine oocyte nuclear maturation, (2) that PKA
is present in oocytes, and (3) that PKA-dependent intracellular mechanisms can mediate
the action of growth factors on porcine oocytes.Les facteurs de croissance IGF-I, IGF-II et EGF peuvent stimuler la maturation nucléaire
de l'ovocyte de porc par la voie intracellulaire de la protéine kinase A. Ces
expériences ont pour but d'étudier in vitro le rôle des facteurs de croissance et des
mécanismes intracellulaires dépendant de la protéine kinase A (PKA) vis-à-vis du contrôle
nucléaire des ovocytes porcins. Des ovocytes ont été cultivés avec ou sans facteurs de
croissance (IGF-I, IGF-II, EGF ;
10 ng⋅mL−1 de milieu) et avec ou sans des inhibiteurs de la PKA (Rp-cAMPS, KT5720 ;
100 ng⋅mL−1). Les stades de la méiose ont été déterminés par examen des chromosomes
après coloration par le Giemza. Les niveaux intracellulaires de PKA ont été évalués
par immunocytochimie en utilisant un anticorps primaire de la sous-unité régulatrice et
de la sous-unité catalytique de PKA et par Western immunoblot avec des anticorps primaires
dirigé contre la sous-unité catalytique. Après 24 h de culture, la majorité des ovocytes a
repris sa maturation nucléaire (stade diplotène dépassé) et elle l'a terminée (stade
métaphase II atteint) après 48 h. L'addition de IGF-I, IGF-II ou d'EGF, ou une combinaison
de IGF-I et d'EGF, accroît significativement la proportion d'ovocytes qui ont repris et
terminé leur méiose. L'addition de IGF-I, IGF-II ou d'EGF s'accompagne d'un accroissement
significatif des cellules exprimant la sous-unité catalytique et dans certains cas la
sous-unité régulatrice de la PKA (immunocytochimie). La présence de deux formes de la
sous-unité catalytique à l'intérieur des ovocytes est montrée en immunoblot (PM 52 et
40 kD environ). EGF mais non IGF-I ou IGF-II augmente le contenu des deux isoformes. Les
inhibiteurs de la PKA, utilisés seuls, ne modifient pas la proportion des ovocytes qui
reprennent ou terminent leur méiose. Cependant ils préviennent les effets stimulants de
IGF-I, IGF-II et EGF. Ces observations suggèrent que : (1) IGF-I, IGF-II et EGF sont des stimulateurs efficaces de la reprise et de l'achèvement de la maturation nucléaire chez le porc,
(2) PKA est présente dans les ovocytes, et (3) les facteurs de croissance peuvent agir
sur les ovocytes porcins par des mécanismes intracellulaires dépendant de la PKA
