Este processo descreve o desenvolvimento de um sistema amperométrico para dosagem da atividade da enzima glutationa redutase em hemolisado de hemácias. O substrato da enzima (GSSG), sua coenzima (NADPH) e um oxidante da glutationa reduzida (DTNB), diluídos em tampão fosfato/EDTA foram depositados em cima de uma membrana lipofílica disposta sobre 2 eletrodos de platina. A amperagem foi monitorada durante 3 minutos após a adição da amostra. A aplicabilidade deste sistema foi avaliada em amostras de hemolisado de hemácias e sua eficiência foi comparada com o método espectrofotométrico de dosagem da atividade da enzima. As vantagens deste novo método são a rapidez e confiabilidade do resultado e a facilidade de ser usado fora do laboratório, permitindo seu uso por profissionais do esporte e da medicina na avaliação de estresse oxidativo.BR0202893 (A)G01N33/573G01N33/573BR20020202893G01N33/573G01N33/57

Alves Armindo Antonio

Kubota Lauro Tatsuo

Toledo Denise Vaz De

Portuguese

Repositorio da Producao Cientifica e Intelectual da Unicamp

SENSOR AMPEROMÉTRICO PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA
ENZIMA GLUTATIONA REDUTASE EM HEMOLISADO DE HEMÁCIAS.
Durante os mecanismos normais de produção de energia, os organismos aeróbios usam
como aceptor final de elétrons a molécula de oxigênio (02), que recebe 4 elétrons e se reduz a
5 H20. Mesmo em condições fisiológicas, cerca de 5% do 02 consumido é reduzido
parcialmente pela adição de 1 elétron, produzindo o radical ânion superóxido (0 2.). Este,
pode levar à formação de potentes oxidantes, que coletivamente são chamadas de espécies
reativas de oxigênio (EROS). Como as biomoléculas são bastante reduzidas, o aumento na
produção de EROS pode aumentar o nível de oxidação celular. A literatura relata a ocorrência
10 de produtos da oxidação de lipídios de membrana, proteínas e ácidos nucléicos, promovida
pelos EROS. Situações em que há um aumento no consumo de oxigênio ou ativação de
oxidases tais como exercício fisico, processos de isquemia/reperfusão e inflamação, levam ao
aumento da produção de EROS. Como forma de defesa, durante a evolução, os organismos
desenvolveram mecanismos para neutralizar essas espécies, o chamado sistema de defesa
15 antioxidante. Este sistema de defesa é constituído, principalmente, pelas enzimas que
detoxicam 02 (familia SOD), H202 (catalase) e peróxidos orgânicos (glutationa peroxidase).
Além destas enzimas, existem ainda os compostos antioxidantes que ao reagirem com os
EROS produzem compostos mais estáveis que podem ser excretados. Entre esses compostos
merecem destaque as vitaminas E, C e A, os carotenóides os flavonóides. O desbalanço entre
20 a produção de EROS e a atividade do sistema antioxidante carateriza uma situação de
estresse oxidativo, que tem sido relacionada a vários processos patológicos como câncer,
arteriosclerose, hipertensão, processos inflamatórios e toxicidade de drogas como etanol,
tetracloreto de carbono paraquat, pentaclorofenol, bromoetano, bromobenzeno, aloxanas,
difenóis e quinonas. Por outro lado, a produção de EROS também está relacionada com a
25 adaptação do indivíduo ao meio porque estimula fatores de transcrição que aumentam a
síntese protéica. Assim, por exemplo, o aumento da concentração de peróxido de hidrogênio
(H202) ativa fatores de transcrição que levam ao aumento na síntese das enzimas superóxido
dismutase dependente de manganês (SOD-Mn), glutationa S-transferase, eritropoetina e
outras, relacionadas com o aumento do sistema de defesa antioxidante e com a recuperação de
30 possíveis lesões (Kretz Remy and Arrigo in: Molecular Biology of Free Radicais in Human
Deseases Aruoma & Halliwel eds., 1988) . A ação positiva dos radicais livres é ainda
relacionada com a defesa do organismo porque os macrófagos digerem os patógenos
bombardeando-os com EROS (Halliwell & Gutteridge, Free Radicais in Biology and
Medicine, ed. Oxford, 1999).
No exercício fisico a produção de EROS parece estar relacionada tanto a processos
adaptativos, para melhoria da performance, quanto ao estabelecimento de processos de fadiga
que tem como conseqüência a diminuição da performance (Venditti & Di Meo. Int. J. Sports
Med, 18(1997)497). Este papel duplo dos EROS torna atraente a possibilidade de
5 monitoramento do estresse oxidativo em atletas de alto nível pois seu controle pode fazer a
diferença para a vitória, já que a diferença de performance entre os competidores é mínima e
os treinamentos são realizados sempre muito perto do limite, o que leva a um aumento na
produção de EROS (Davies, et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 107(1982)1198).
A literatura mostra que o processo adaptativo induzido pelo treinamento fisico leva ao
10 aumento na atividade das enzimas do sistema antioxidante, principalmente a glutationa
peroxidase (GPx), para responder a uma maior concentração de EROS induzida pelo aumento
do consumo de 02 (Sen, C.K.,J. Appl. Physiol. 79 (1995)675). Esta enzima reduz 11202 e
hidroperóxidos lipídicos a H20 ou álcoois, substâncias não tóxicas, usando como agente
redutor a glutationa reduzida (GSH) que se oxida a um dímero de glutationa oxidada (GSSG).
15 Como a GPx tem alta afinidade por hidroperóxidos é considerada a enzima mais importante
na detoxicação da célula nas situações em que a produção de EROS é baixa. É fundamental
para as células manterem uma razão GSH/GSSG alta para estarem preparadas para qualquer
aumento na produção de EROS. A enzima glutationa redutase (GR) participa do ciclo redox
da glutationa, reduzindo a GSSG a 2 moléculas de GSH, às custas da oxidação do NADPH.
20 Esta enzima é ativada quando há necessidade de uma reposição rápida de GSH e sua
monitoração espelha o funcionamento do sistema da glutationa. Resultados recentes do nosso
grupo de pesquisa, mostram que a enzima GR é bastante sensível a protocolos de treinamento,
sendo, portanto, um bom marcador do processo adaptativo induzido pelo exercício (Smolka et
ali, Am.J.Physiol.(2000) 279).
25 Dentro deste contexto, é muito importante o desenvolvimento de novas metodologias
para determinar parâmetros de estresse oxidativo de maneira rápida, precisa e com
equipamentos que possam ser utilizados no campo. Os sensores amperométricos apresentam-
se como uma ferramenta ideal para o monitoramento destes parâmetros em campo, porque
permitem metodologias simples, pequena quantidade de amostra, respostas rápidas e
30 equipamentos pequenos, que não demandam uma grande fonte de energia. O sensor
amperométrico para dosagem da atividade da enzima GR apresenta-se como um instrumento
útil para monitorar atividades e tratamentos que levem a situações de estresse oxidativo, em
atletas ou pacientes, de fonna eficiente e rápida. Destaque ainda para o baixo custo, já que
neste sensor usa-se apenas 7 III, de meio de reação, ao passo que no espectrofotômetro se
usaria, no mínimo, 1 mL. O volume de amostra também é muito menor, já que para preparar
3111, de hemolisado de hemácias pode se usar uma gota de sangue, retirada do dedo ou do
lóbulo da orelha do sujeito. Isto permite que a análise seja feita "in situ", garantindo
5 diagnósticos mais rápidos e fidedignos, permitindo uma intervenção mais rápida visando
neutralizar os efeitos do estresse.
O uso deste sensor, permite a intervenção rápida da equipe técnica, durante o
treinamento de atletas. Caso a atividade da GR em um atleta caia, pode-se prescrever um
treinamento mais leve e aeróbio para fortalecer o sistema antioxidante. A recuperação também
10 pode ser acompanhada pelo aumento na atividade desta mesma enzima no plasma. Após a
recuperação do sistema antioxidante, o atleta poderá então aumentar a carga de treino, na
certeza de que seu sistema de defesa antioxidante está preparado para isso. Hoje este tipo de
exame pode ser feito em laboratórios bastante específicos, sendo portanto caro e de acesso
restrito, mesmo nos grandes centros desportivos.
15 Para as outras situações descritas como: processos inflamatórios, câncer, AIDS, etc.
onde a monitoração do estresse oxidativo é um importante dado para diagnosticar e avaliar a
evolução do tratamento, a utilização deste biossensor, permite de forma rápida e precisa
prática e econômica o acompanhamento preciso da recuperação.
O método descrito neste projeto, baseia-se no principio de que a reação catalisada pela
20 enzima glutationa redutase é uma reação de oxido redução:
GSSG + 2NADPH	 2GSH	 2NADP+
Podendo ser descrita pelas duas semi-reações:
GSSG + 2H+ + 2e- 	 2GSH (E0 = -0,230 V)
NADP+ + H+ + 2e-	NADPH (E'0 = -0,324 V)
A voltagm utilizada permite a monitoração da formação destas duas espécies: GSH e
NADPH.
25 O sistema apresentado neste processo foi desenvolvido utilizando-se dois eletrodos de
platina ligados a um amperímetro, conforme demonstrado na Figura 1. Os eletrodos, são
imobilizados entre duas placas de teflon, sendo que a placa de cima possui um orificio, que ao
sistema ser montado dá origem a uma cavidade onde vai ocorrer a reação. Sobre os eletrodos
é colocada uma membrana hidrofóbica (PVDF, 0,45 gm Millipore) sobre a qual é
4/5
depositado o meio de reação e a amostra, nos momentos adequados, conforme descrito abaixo
Coloca-se 7 ui, do meio de reação e após 3 minutos de estabilização, adiciona-se 3µL da
amostra e acompanha-se a variação da corrente aplicando uma diferença de potencial entre os
eletrodos de platina de -300 mV durante 3 minutos registrando-se a corrente (nA) antes e após
5 a adição da amostra. Desse valor é descontado o valor da variação da corrente quando se
adicionou, nas mesmas condições somente 3 do tampão no qual está dissolvida a enzima
ou as amostras de hemolisado (branco).
As amostras para fazer a curva padrão apresentada na figura 1 foram preparadas
dissolvendo-se quantidade adequadas da enzima pura em tampão fosfato 0,2 M com EDTA 1
10 mM, pH 7,4.
A amostra de hemolisado de hemácias foi preparada com sangue total hemolisado
(1:1 com água) diluído 20 vezes com tampão fosfato 0,2 M/EDTA 1 mM pH 7,4.
O meio de reação é constituído de tampão fosfato 0,2M /EDTA 1 mM, pH 7,4,
DTNB 3 mM, NADPH 2 mM, e GSSG 20 mM (Smith et al, Anal.Biochem175 (1988) 408).
15 Nas condições aqui apresentadas, usando-se uma diferença de potencial de –300 mV,
o aumento da corrente observado, pode ser relacionado à oxidação do NADPH. A adição de
DTNB serviu para tornar a reação mais estável, retirando o produto da reação a GSH.
A Figura 2 mostra que o sensor é sensível na faixa de atividade da GR que varia de
0,025 a 0,40 UI/mL, r = 0,9989 e p < 0,0001. A tabela 1 mostra que para amostras de
20 hemolisado de hemácias, não houve diferenças significativas (desvio relativo < 10%) quando
os valores obtidos pelo biossensor são comparados com os obtidos no método
espectrofotométrico descrito por Smith et al (Anal. Biochem. 175 (1988) 408).
Estes dados mostram que o biossensor apresentou sensibilidade comparada ao método
clássico, com a vantagem de poder ser utilizado fora do laboratório, "in situ", permitindo um
25
	
	
diagnóstico rápido, preciso e barato e assim tornando possível sua utilização por profissionais
da saúde e do esporte para monitoramento de estresse oxidativo em atletas e pacientes.
Tabela 1
Amostras GR (UI/mL) Desvio relativo
Homogenato de Método Método (%)***
hemácias espectrofotométrico* amperometrico**
1 0,102 ± 0,004 0,096 ± 0,02 5,6
2 0,120 ± 0,006 0,109 ± 0,04 9,7
0,13	 ± 0,01 0,137 ± 0,04 -0, 1
4 0,132 ± 0,01 0,126 ± 0,03 4,2
5 0,114 ± 0,02 0,122 ± 0,05 -6,8
6 0,106 ± 0,04 0,104 ± 0,02 2,1
7 0,152 ± 0,02 0,146 ± 0,02 3,8
8 0,176 ± 0,04 0,169 ± 0,05 4,0
* Utilizando o método descrito por Smith et al, Anal.Biochem. 175 (1988) 408
** Utilizando o sensor descrito neste processo.
*** Desvio percentual dos dados do método amperométrico utilizando o método
5 espectrofotométrico como referência.
AA – Placas de teflon
B - Membrana hidrofóbica
C - Eletrodos de platina
D - Amperímetro
Figura 1.
Y=a+bX
a = 4,19046
b 4348,54574
R = 0,9989
60
2/2
50 -
40 -
c
-;,3 -
a)
c
a)
O- 20
10-
1	 '	 1	 1	 1	 1
0,000	 0,002	 0,004	 0,006	 0,008	 0,010
Enzima glutationa redutase (mg/mL)
Figura 2
REIVINDICAÇÕES
1. "SENSOR AMPEROMÉTRICO PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA
ENZIMA GLUTATIONA REDUTASE EM HEMOLISADO DE HEMÁCIAS"
caraterizado pela construção de um sistema amperométrico, capaz de determinar e quantificar
5 a atividade da enzima glutationa redutase.
2. "SENSOR AMPEROMÉTRICO PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA
ENZIMA GLUTATIONA REDUTASE EM HEMOLISADO DE HEMÁCIAS"
caraterizado por usar o sensor amperométrico para análise da atividade da enzima glutationa
redutase em amostras de hemolisado de hemácias e correlacionar os resultados com variações
10 no nível de estresse oxidativo de indivíduos expostos a estresse por patologias ou pelo
treinamento fisico.
3."SENSOR AMPEROMÉTRICO PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA
ENZIMA GLUTATIONA REDUTASE EM HEMOLISADO DE HEMÁCIAS"
caraterizado por usar o sensor amperométrico para análise de estresse oxidativo em
15	 indivíduos.
RESUMO
SENSOR AMPEROMÉTRICO PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA
ENZIMA GLUTATIONA REDUTASE EM HEMOLISADO DE HEMACIAS.
Este processo descreve o desenvolvimento de um sistema amperométrico para
5 dosagem da atividade da enzima glutationa redutase em hemolisado de hemácias.
O substrato da enzima (GSSG), sua coenzima (NADPH) e um oxidante da glutationa
reduzida (DTNB), diluídos em tampão fosfato/EDTA foram depositados em cima de uma
membrana lipofflica disposta sobre 2 eletrodos de platina. A amperagem foi monitorada
durante 3 minutos após a adição da amostra. A aplicabilidade deste sistema foi avaliada em
10 amostras de hemolisado de hemácias e sua eficiência foi comparada com o método
espectrofotométrico de dosagem da atividade da enzima. As vantagens deste novo método são
a rapidez e confiabilidade do resultado e a facilidade de ser usado fora do laboratório,
permitindo seu uso por profissionais do esporte e da medicina na avaliação de estresse
oxidativo.


Sensor Amperométrico Para Determinação Da Atividade Da Enzima Glutationa Redutase Em Hemolisado De Hemacias

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