Este processo descreve o desenvolvimento de biossensores amperométricos para compostos fenólicos. Lacase (extrato bruto) foi imobilizada em eletrodos de fibra de carbono utilizando-se diferentes processos: adsorção física, glutaraldeído, carbodiimida e carbodiimida/glutaraldeído. O biossensor de maior sensibilidade foi obtido usando a imobilização com carbodiimida/glutaraideído. Neste método, diferentes porcentagens de glutaraldeído mostraram um importante efeito na sensibilidade do biossensor. O comportamento do biossensor foi testado em termos da sensibilidade, faixa operacional, pH e potencial aplicado. O biossensor desenvolvido mostrou uma resposta máxima em pH 5,0 e com o potencial de -100 mV. A lacase imobilizada manteve sua atividade por mais de dois meses.BR0004323 (A)G01N27/327G01N27/327BR20000004323G01N27/327G01N27/32

Caballero Nelson Eduardo Duran

Freire Renato Sanches

Kubota Lauro Tatsuo

Portuguese

Repositorio da Producao Cientifica e Intelectual da Unicamp

"BIOSSENSOR AMPEROMÉTRICO PARA DETERMINAÇÃO DE
COMPOSTOS FENÓLICOS - ELETRODOS DE MATERIAIS CARBONÁCEOS
COM LACASE IMOBILIZADA"
Nos últimos anos, as fibras de carbono têm sido largamente estudadas em
5 processos eletroquímicos e eletroanalíticos, principalmente na construção de
microeletrodos (Agüí e col., Electroanalysis 9 (1997) 468; Carvalho e col., J.
Electroanal. Chem. 457 (1998) 83). Uma importante vantagem apresentada pelos
eletrodos de fibras de carbono é presença de grupos carboxílicos e hidroxilícos em
sua superfície, que permitem sua modificação e imobilização de muitas espécies,
10 dentre as quais enzimas (Ju e col., Talanta 43 (1996) 1177). Esta última
característica, pode ser empregada na construção de biossensores eletroquímicos,
desde que a Imobilização de biomoléculas na superfície dos eletrodos possui um
papel fundamental no desenvolvimento deste tipo de sensor (Krõger e col., Biosens.
Bioelectron 14 (1999) 155). O emprego de microbiossensores apresenta grandes
15 vantagens na determinação de, por exemplo, metabólitos e poluentes in vivo e in
situ (Cosnier, Biosens. Bioelectron 14 (1999) 443). Entretanto, a imobilização de
macrobiomoléculas, na sua forma estável e com a manutenção de suas
propriedades biológicas de reconhecimento sobre microsuperfície condutoras
apresenta-se como um dos grandes desafios para a construção de biossensores
20 miniaturizados (Nistor e col., Waste Manage 19 (1999) 147; Heilmann e col.,
Patente DE19835869-A1). Os procedimentos de ligação cruzada, ligação covalente
e encapsulamento em géis ou membranas são os métodos de imobilização de
biomoléculas mais convencionais. Contudo, em alguns casos estes processos
apresentam uma baixa reprodutibilidade, além de problemas de homogeneidade
25 durante o processo de deposição das biomoléculas sobre a superfície dos eletrodos
(May, Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 370). A fim de se obter eletrodos que
apresentem alta sensibilidade, é necessário que a molécula do substrato possa
interagir com superfície sem restrições estéricas. Idealmente, este objetivo pode ser
atingido através da imobilização da parte protéica, em um ponto que não afete o
30 centro ativo da enzima.
Biossensores apresentam-se como uma ferramenta ideal no monitoramento
ambiental, principalmente devido a sua habilidade em operar com matrizes
complexas, curto tempo de resposta e pequeno tamanho (Dennison e col., Biotech.
Adv. 13 (1995) 1). A determinação de fenol e seus compostos derivados é de
extrema importância ambiental, desde que estas espécies são largamente
5 despejadas no meio ambiente por um grande número de industrias, como por
exemplo: manufatura de plásticos, corantes, drogas, antioxidantes, polpa e papel
(Nistor e col., Anal. Chim. Acta 387 (1999) 309). Nos últimos anos biossensores
eletroquímicos modificados com as enzimas tirosinase (Russel e col., Anal Chim
Acta 389 (1999) 161), HRP (Rosatto e col., Anal. Chim. Acta 390 (1999) 65) e
10 lacase (Yaropolov e col., Anal. Chim. Acta, 308 (1995) 137; Bogdanovs e col.,
Patente DD280790-A) têm sido desenvolvidos para a determinação de fenóis. O uso
de extratos brutos oferece algumas vantagens com relação aos procedimentos
baseados em enzimas puras ou isoladas, especialmente por promover um maior
tempo de vida e menor custo (Vieira e col., Anal. Letters 30 (1997) 895).
15 O biossensor apresentado nesta invenção foi construído utilizando-se cerca
de 10-20 fibras de carbono (5mm de espessura) e extrato bruto de lacase obtido a
partir do fungo Trametes versicolor.
Antes da imobilização enzimática as fibras foram pré-tratadas com a
aplicação de um potencial estacionário de +0,8 V por 180 segundos, em tampão
20 fosfato 0,1 mol pH 7,2 . Após este processo a imobilização da lacase sobre as
fibras de carbono foi realizada por quatro diferentes processos: adsorção física,
ligação covalente com carbodiimida, ligação cruzada com glutaraldeído e ligação
covalente com carbodiimida/giutaraldeído.
A Tabela 1 mostra a sensibilidade dos biossensores na determinação de
25 catecol, obtida para cada processo de imobilização enzimática, estes valores foram
obtidos com a aplicação de potencial no valor de –100 mV vs SCE em tampão
fosfato 0,1 moi pH 5,0. Os resultados mostram que o método de imobilização
enzimático via adsorção física resulta em um biossensor com baixa sensibilidade,
enquanto que os métodos com glutaraldeído e carbodiimida apresentam
30 biossensores com melhores sensibilidades. A carbodiimida é capaz de promover
uma forte ligação entre a enzima e o eletrodo, entretanto esta fixação é feita através
de grupos carboxílicos, sendo que o centro ativo da lacase pode conter este tipo de
grupo. Desta forma, a imobilização através da carbodiimida pode levar a uma
redução na atividade enzimática. Por outro lado, o glutaraldeído promove uma boa
reticulação enzimática aumentando a quantidade de enzima por área, mas não é
5 efetivo na fixação das enzimas reticuladas sobre a superfície do eletrodo.
O procedimento para a imobilização de lacase sobre as fibras de carbono foi
obtido utilizando-se carbodiimida e glutaraldeído simultaneamente, devido ao efeito
sinérgico entre estas duas metodologias isoladas, combinando a boa fixação
apresentada pelo método com carbodiimida com a boa reticulação obtida pelo
método com glutaraldeído, resultando em um biosensor com alta sensibilidade.
A Tabela 1 mostra o aumento na sensibilidade do biossensor em função do
aumento da porcentagem de glutaraldeído % (mlv). Para soluções com
porcentagens de glutaraldeído acima de 10% foi observado uma diminuição na
atividade enzimática, provavelmente devido a um alto grau de reticulação
15 enzimática, promovido pelo glutaraldeído, que dificulta o acesso do substrato ao
centro ativo da enzima.
A Figura 1 mostra o efeito do pH na resposta do biossensor (solução de
catecol 100 p,mol L-1 , potencial aplicado: -100 mV vs SCE) . Para soluções com pH
acima de 6,5 a sensibilidade do biossensor decresce rapidamente, sendo que um
20 máximo de resposta é obtido em pH ao redor de 5,0. Esta faixa ótima de pH é
similar a observada para lacases solúveis e purificadas. Isto indica que o processo
de imobilização não afeta a carga da enzima.
O potencial aplicado durante a medida eletroquímica exerce um forte efeito
sobre a resposta do biossensor, conforme mostra a Figura 2 (solução de catecol
25 100 µg101 L-1 em tampão fosfato pH 5,0). Apesar da resposta do biossensor
aumentar em potenciais mais negativos, fixou-se o valor de –100 mV, devido a este
potencial apresentar uma boa razão sinal/ruído e estar menos sujeito a
interferências de compostos não fenólicos, principalmente em matrizes complexas.
A curva analítica, obtida para catecol, usando o biossensor desenvolvido com
30 o método carbodiimida/glutaraldeído (potencial aplicado: -100 mV vs SCE, eletrólito
suporte: tampão fosfato 0,1 moi	 pH 5,0) mostrou uma faixa linear de resposta
entre 1 e 90 p,mol L-1 , conforme mostra a Figura 3. A equação de ajuste desta curva
é dada por i(nA) = 0.33 (±0.15) + 16.10 (±0.25) [catecoll(p,mol 1: 1 ), com um
coeficiente de correlação de 0,9998 para n = 25. Deste modo, o biossensor
desenvolvido apresentou uma excelente faixa operacional e ótima sensibilidade.
5 A constante aparente de Michaelis-Menten deste biossensor foi estimada em
0,61 mmol L-1 (catecol como substrato), para lacase em solução o valor encontrado
foi de 3,9 mmol L-1 . Este resultado mostra que o procedimento de imobilização
promoveu um aumento significativo na seletividade da lacase.
O biossensor desenvolvido mostrou-se eficiente na detecção e quantificação
10 de diferentes compostos fenólicos e clorofenóis em matrizes ambientais,
demonstrando sua importância no monitoramento ambiental de efluentes industriais.
Tabela 1
Método de imobilização
Sensibilidade
(nA /1.tmol.L-1)
Coeficiente de
correlação (r2)
C.V
(%)
Adsorção física 0.60 ± 0.05 0.989 10.2
Ligação cruzada com glutaraldeído 10% 2.05 ± 0.09 0.995 5.1
Ligação covalente com carbodiimida 3.69 ± 0.17 0.996 4.7
Carbodiimida + glutaraldeído 1.5% 6.49 ± 0.148 0.998 2.8
Carbodiimida + glutaraldeído 2.5% 9.12 ± 0.23 0.998 2.6
Carbodiimida + glutaraldeído 5% 14.32 ± 0.27 0.999 1.9
Carbodiimida + glutaraldeído 10% 16.07 ± 0.27 0.999 1.7
Carbodiimida + glutaraldeído 15% 1.13 ± 0.05 0.989 5.6
REIVINDICAÇÕES
1. "BIOSSENSOR AMPEROMÉTRICO PARA DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS
FENÓLICOS - ELETRODOS DE MATERIAIS CARBONÁCEOS COM LACASE
IMOBILIZADA", caracterizado pelo desenvolvimento, descrição, montagem e
5 otimização de um biossensor amperométrico, capaz de descriminar e quantificar
diferentes compostos fenólicos.
2. "BIOSSENSOR AMPEROMÉTRICO PARA DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS
FENÓLICOS - ELETRODOS DE MATERIAIS CARBONÁCEOS COM LACASE
IMOBILIZADA", caracterizado pela imobilização de lacase em eletrodos de
10 materiais carbonáceos, principalmente em fibra de carbono, para a determinação de
compostos fenólicos.
3. "BIOSSENSOR AMPEROMÉTRICO PARA DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS
FENÓLICOS - ELETRODOS DE MATERIAIS CARBONÁCEOS COM LACASE
IMOBILIZADA", caracterizado pelo uso de extrato bruto de lacase produzida por
15 fungos como, por exemplo, o Trametes versicolor.
4. "BIOSSENSOR AMPEROMÉTRICO PARA DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS
FENÓLICOS - ELETRODOS DE MATERIAIS CARBONÁCEOS COM LACASE
IMOBILIZADA", caracterizado pelo uso em análises de efluentes industriais.
7.56.5 7.04.5	 5.0 5.5	 6.0
O i	 1
pH
Figura 1
-----
<
c
--...
350
300-
250-
200-
150-
100-
••••..
1111
50 -
400 -
300 -
C
100 -
,	 1	 •	 1	 •	 1
-0.20	 -0.15	 -0.10	 -0.05	 0.00	 0.05
	
0.10
potencial / V vs SCE
Figura 2
1800 	
1600 -
1400 -
1200 -
4
c 1000 -
--.
800
600 -
20	 40	 60	 80
[catecol] / µl101 L-1
Figura 3
RESUMO
"BIOSSENSOR AMPEROMÉTRICO PARA DETERMINAÇÃO DE
COMPOSTOS FENÕLICOS - ELETRODOS DE MATERIAIS CARBONÁCEOS
COM LACASE IMOBILIZADA"
5 Este processo descreve o desenvolvimento de biossensores amperométricos
para compostos fenólicos. Lacase (extrato bruto) foi imobilizada em eletrodos de
fibra de carbono utilizando-se diferentes processos: adsorção física, glutaraldeído,
carbodiimida e carbodiimida/glutaraldeído.
O biossensor de maior sensibilidade foi obtido usando a imobilização com
io carbodiimida/glutaraideído. Neste método, diferentes porcentagens de glutaraldeído
mostraram um importante efeito na sensibilidade do biossensor. O comportamento
do biossensor foi testado em termos da sensibilidade, faixa operacional, pH e
potencial aplicado. O biossensor desenvolvido mostrou uma resposta máxima em
pH 5,0 e com o potencial de –100 mV. A lacase imobilizada manteve sua atividade
15 por mais de dois meses.


Biossensor Amperométrico Para Determinação De Compostos Fenólicos - Eletrodos De Materiais Carbonáceos Com Lacase Imobilizada

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Biossensor Amperométrico Para Determinação De Compostos Fenólicos - Eletrodos De Materiais Carbonáceos Com Lacase Imobilizada

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