Detecção de vírus da videira por RT-PCR em tempo real e por extensão de primers alelo-específicos e caracterização molecular de isolados do Nordeste Brasileiro
A videira (Vitis spp.) pertence à família Vitaceae, sendo as espécies botânicas V. vinifera L. e V. labrusca L. cultivadas em maior escala devido seus produtos, consumidos na forma de frutos in natura, geleias, sucos e vinhos. Apesar da grande importância econômica, vários fatores podem comprometer a produção desta cultura, incluindo as doenças causadas por vírus. O presente trabalho teve como objetivos verificar a incidência de vírus presentes em vinhedos comerciais de duas áreas produtoras do Nordeste do Brasil e avaliar a eficiência de alguns métodos moleculares para detecção e identificação de espécies virais associadas à videira. Amostras, apresentando ou não sintomas, foram coletados de genótipos de videira em propriedades situadas em Pernambuco, Paraíba, Bahia e Rio Grande do Sul, Brasil, e em Locorotondo, Província de Bari, Região da Puglia, Itália. A primeira parte do trabalho foi conduzida no Laboratório de Virologia da Embrapa Uva e Vinho, RS, Brasil. Visando a identificação dos agentes virais, nas amostras coletadas no Brasil, foram realizadas as extrações do RNA total, obtidos os cDNAs e testados por PCR em Tempo Real, empregando-se primers e sondas, específicos para os seguintes vírus: Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (GRSPaV), Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB), Grapevine leafroll-associated virus 2, 3 e 4 (GLRaV-2, -3 e -4), Grapevine fleck virus (GFkV), Grapevine rupestris vein feathering virus (GRVFV) e Grapevine fanleaf virus (GFLV). Fragmentos de DNA, produtos da RTq-PCR, correspondentes ao gene da CP de cada vírus foram eluídos, ligados ao vetor pGEM-T Easy (Promega) e utilizados na transformação de bactéria. Foi extraído o DNA plasmidial das colônias bacterianas transformadas, confirmando-se a presença dos fragmentos clonados, os quais foram sequenciados. A segunda parte, realizada com o material coletado em Locorotondo, foi processada no Istituto per la Protezione Sostenibile delle Piante (CNR-IPSP) e no Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti, Università degli Studi “Aldo Moro”. Foram utilizadas, a partir de cDNAs obtidos, técnicas de amplificação baseadas na Allele Specific Primer Extension (ASPE), visando detectar em teste multiplex os vírus mais relevantes envolvidos na etiologia da degenerescência e nos complexos do enrolamento das folhas e do lenho rugoso da videira. Os resultados obtidos mostraram que as técnicas agregam algumas vantagens, como a redução no tempo e relativa simplicidade de execução, eliminando completamente o uso de reagentes tóxicos, a exemplo do brometo de etídeo. O uso de multiplex facilita a amplificação de múltiplos alvos em uma única reação, reduzindo o tempo e o custo das análises.The grapevine (Vitis spp.) belongs to the family of Vitaceae, being the botanical species V. vinifera L. and V. labrusca L. the most and widely cultivated, due to their products consumed as fresh fruits, jam, juices and wines. Despite the high economical importance, several factors may severely affect this crop, including the diseases caused by viruses. This study aimed to verify the incidence of virus present in commercial vineyards of two producing areas in Northeastern Brazil and evaluate the efficiency of some molecular methods for detecting and identifying viral species associated with grapevine. Materials showing or not symptoms were collected from grapevine genotypes in vineyards of Pernambuco, Paraiba, Bahia and Rio Grande do Sul, Brazil, and Locorotondo, Province of Bari, of the Puglia Region, Italy. The first part of the work was conducted at the Virology Laboratory of the Embrapa Uva e Vinho, RS, Brazil. For the identification of viral agents in the samples collected in Brazil, the extraction of total RNA was performed, cDNAs were obtained and tested by real time RT-PCR, using primers and probes specific for the following viruses: Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (GRSPaV), Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB), Grapevine leafroll-associated virus 2, 3 e 4 (GLRaV-2, -3 e -4), Grapevine fleck virus (GFkV), Grapevine rupestris vein feathering virus (GRVFV) and Grapevine fanleaf virus (GFLV). DNA fragments, products of the RT-qPCR, corresponding to the CP gene of each virus were eluted, linked to pGEM-T Easy vector (Promega) and used to transform bacteria. The plasmid DNA was extracted from transformed bacterial colonies, confirming the presence of the cloned fragments, which were sequenced. The grapevine material collected in Locorotondo was processed at the Istituto per la Protezione Sostenibile delle Piante (CNR-IPSP) and at the Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti, Università degli Studi “Aldo Moro”. In order to detect in multiplex test the most relevant viruses involved in the aetiology of fanleaf degeneration and the complexes of leafroll and rugose wood of grapevine, amplification techniques based on Allele Specific Primer Extension (ASPE) were tested by using the obtained cDNAs. The results showed that the techniques aggregate some advantages, such as reduction in time and relative simplicity of implementation, completely eliminating the use of toxic reagents, such as the ethidium bromide. The use of multiplex facilitates amplification of multiple targets in a single reaction, reducing the time and cost of the analyzes
